CRISPR (inglizcha clustered regularly interspaced short palindromic repeats — qisqa palindromik takrorlarning muntazam guruhlari) — alohida lokuslar bakteriyalar va arxeyalarda mavjud bo‘lib, bevosita takrorlanuvchi ketma-ketliklardan iborat bo‘lib, ular noyob ketma-ketliklar (speyserlar) bilan bir-biridan ajratilgan. Speyserlar begona genetik elementlardan olinadi; ular bilan avval hujayra to‘qnashgan (bakteriofaglar, plazmidalar). RNK, CRISPRga bog‘liq lokuslardan transkripsiyalanib, ular bilan bog‘liq oqsillar Cas bilan birga moslashuvchan immunitetni komplementar RNKning nuklein kislotalar bilan komplementar bog‘lanishi va begona elementlarning Cas oqsillari tomonidan keyin parchalanishi hisobiga ta’minlaydi. Shu bilan birga, hozirgi vaqtda CRISPRning immunitet bilan bog‘liq bo‘lmagan jarayonlarda ham qatnashishini ko‘rsatuvchi ko‘plab dalillar mavjud.

Zamonaviy gen muhandisligida CRISPR-Cas usullari^[ingl.] yordamida maqsadli tahrirlash jarayonini genomlarda amalga oshirish istiqbolli yo‘nalish hisoblanadi. 2016-yil holatiga ko‘ra olimlar CRISPR-Cas tizimlariga asoslangan yondashuvlardan keng foydalanadi. 2023-yildan boshlab bu yondashuvlar tibbiyotda qo‘llanila boshlandi, xususan, irsiy kasalliklarni davolashda.

CRISPR-Cas dori vositalarini aniq manzilga yetkazish va tashqi ta’sir ostida ajratib chiqarishda ham ahamiyatga ega. Buning uchun tarkibida DNK qismlari bo‘lgan materiallardan foydalaniladi.

Birinchi CRISPR lokusi Escherichia coli bakteriyasida 1987-yilda yaponguruhi olimlari tomonidan, ularga Yosidzumi Isino^[ingl.] boshchilik qilgan paytda aniqlangan. Ular ushbu bakteriya genomida takrorlanmaydigan ketma-ketliklar (speyserlar) bilan ajratilgan takrorlanuvchi elementlarni payqashgan, biroq dastlab bu kuzatuvga katta ahamiyat berishmagan. CRISPRni keng ko‘lamda o‘rganishni ispaniyaliktadqiqotchi Fransisko Moxika boshlagan. U 1993-yilda Haloferax mediterranei arxeyasi genomida oraliqlar bilan ajratilgan takrorlanuvchi ketma-ketliklarni aniqlagan. U mazkur arxeya va E. coli genomidagi takrorlar tuzilishi jihatidan juda o‘xshashligini, biroq nukleotidlar ketma-ketligi jihatidan umumiylikka ega emasligini payqagan. Moxikaning taxminiga ko‘ra, sistematik jihatdan bir-biridan juda uzoq prokariotlarguruhlarida tuzilishi o‘xshash bunday takrorlar juda muhim vazifani bajarishi kerak edi. Dastlab u takrorlarning yangi sinfini «muntazam oraliqlar bilan ajratilgan qisqa takrorlar» (ingl. short regularly spaced repeats, SRSRs) deb atagan, biroq keyinchalik uning taklifi bilan bu nom «muntazam guruhlangan qisqa palindromik takrorlar» (ingl. clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR) deb o‘zgartirilgan. Moxika boshqa mikroblar genomida CRISPRni izlashni davom ettirib, 2000-yilgacha ularni 20 ta mikroorganizmda, jumladan, o‘lat qo‘zg‘atuvchisi Yersinia pestis hamda boshqa patogenlarda aniqlagan. 2002-yilda genlar cas — Cas oqsillarini kodlaydigan CRISPR lokuslari genlari kashf etilgan.

Turli xil prokariotlarda CRISPR-Cas tizimlari aniqlangan bo‘lsa-da, 2005-yilgacha CRISPR vazifalari haqida deyarli hech narsa ma’lum emas edi. 2005-yilda Moxika va hamkasblari yangi tadqiqotlari natijalarini e’lon qilib, speyserlar bakteriofaglar genomidagi ketma-ketliklarga, shuningdek, plazmidalar qismlariga mos kelishini aniqlashdi. Ular, shuningdek, E. colining CRISPR lokuslarida P1 fagi ga mos speyser mavjud bo‘lgan shtammlari shu fagga chidamli ekanini aniqlab, CRISPR lokuslari prokariotlarning moslashuvchan immuniteti bilan bog‘liq, degan xulosaga kelishdi. O‘sha yili yana ikki tadqiqot guruhi ham shunday xulosaga kelgani haqida maqolalar e’lon qilindi.

2006-yilda ma’lum CRISPR tizimlari tasnifi ishlab chiqildi va CRISPRga asoslangan moslashuvchan immunitetning ehtimoliy ishlash mexanizmi taklif etildi. 2007-yilda Filipp Xorvat^[ingl.] boshchiligidagi tadqiqot guruhi CRISPRning muayyan nishon ketma-ketliklarga xos moslashuvchan immunitetni ta’minlashdagi ishtirokini uzil-kesil aniqlab, tajribada isbotladi; bu jarayonda Cas oqsillarining asosiy roli ham aniqlandi. Ushbu yutug‘i uchun u 2015-yilda Massri mukofoti (ingl. Massry Prize) bilan CRISPRni o‘rganishga katta hissa qo‘shgan boshqa olimlar (Jennifer Daudna va Emmanyuel Sharpantye) qatorida taqdirlandi. 2008-yilda CRISPR tizimi ishlashi uchun maxsus usulda qayta ishlangan CRISPR-RNK (crRNK) zarurligi ko‘rsatildi va CRISPR tizimining DNK-interferensiyasini amalga oshirish qobiliyati namoyish etildi. Interferensiya, yo‘naltiruvchi RNKlar va DNKning muayyan ketma-ketliklariga yo‘naltirilgan ta’sir — 2007—2008-yillarda qilingan ushbu uch kashfiyot CRISPRga asoslangan genetik muhandislik usullarining rivojlanishiga asos soldi.

II turdagi CRISPR tizimlarining tuzilishi bilan bog‘liq keyingi bir qator muhim kashfiyotlar (jumladan, uning ishlashi uchun Cas9 oqsili va crRNKdan tashqari tracrRNK deb ataladigan qo‘shimcha kichik RNK zarurligi aniqlanishi) 2012-yilda ilk sun’iy yaratilgan II turdagi CRISPR tizimini tajribada sinab ko‘rish imkonini berdi. 2013-yil boshida (taxminan ikki haftalik oraliq bilan) bir nechta guruh sun’iy CRISPR-Cas tizimlari nafaqat bakteriya hujayralarida va in vitro, balki eukariotlar hujayralarida ham ishlashini ko‘rsatdi. 2012-yilda litvalik biokimyogar Virginijus Shikshnis birinchilardan bo‘lib CRISPR-Cas tizimi tarkibidagi Cas9 oqsili yordamida DNKni dasturlashtirilgan tarzda parchalash mumkinligini namoyish etdi. 2007-yildan boshlab uning asosiy tadqiqot yo‘nalishi bakteriyalarni bakteriofaglar va begona genetik materialdan himoya qiluvchi, yaqinda kashf etilgan CRISPR-Cas tizimlarini o‘rganish edi. Shikshnisning so‘zlariga ko‘ra, uning maqolasi ilmiy jurnal tahririyati tomonidan hatto jiddiy ko‘rib chiqilmagan va taqrizchilarga yuborilmagan; shu bois uning ishining birinchiligini tan olish uchun zarur vaqt boy berilgan. Martin Shlakning xabar berishicha, Shikshnis Cas9 yordamida DNK parchalanishini tasvirlagan maqolasini taqrizdan o‘tadigan Cell Reports^[ingl.] 18-aprel 2012-yilda taqdim etgan. Maqola ekspert bahosisiz rad etilgach, bir oy o‘tib uni taqrizli ilmiy jurnalga yubordi: PNAS ilmiy jurnaliga yuborgan; uni ko‘rib chiqish va chop etish bir necha oy davom etgan. Bu orada amerikalik biokimyogar Jennifer Daudna va fransiyalik mikrobiolog Emmanyuel Sharpantye o‘z maqolasini Science ilmiy jurnalida e’lon qilishdi; u ikki hafta ichida ko‘rib chiqilib, qabul qilindi. Ko‘p o‘tmay Cas9 yordamida genomni tahrirlash texnologiyasi DuPont kompaniyasiga litsenziyalandi. CRISPR-Cas9 yordamida genomni tahrirlashga imkon beruvchi yangi texnologiyalarni yaratgan Emmanyuel Sharpantye va Jennifer Daudna qo‘lga kiritdilar — kimyo bo‘yicha Nobel mukofotini (2020-yil).

Keyingi ikki yarim yil davomida CRISPR usullari ishlab chiqildi va ular turli organizmlarguruhlarida qo‘llanildi. 2015-yil aprelida xitoylik olimlar guruhi CRISPR-Cas9 yordamida inson embrionlari genomlari tahrirlangan tadqiqot natijalarini chop etdi. Biroq bu tajribada tahrirlash aniqligi juda past bo‘ldi va tajribaning o‘zi ilmiy jamoatchilikda turlicha munosabat uyg‘otdi. 2016-yil boshida AQSH olimlari CRISPR-Cas9 ishlashidagi xatolarni deyarli nolgacha kamaytirishga erishganliklarini ma’lum qilishdi. Hozir CRISPR hayot haqidagi fanlarda bundan uch o‘n yillik avval kashf etilgan polimeraza zanjir reaksiyasi (PZR) ixtiro qilingandan buyon eng muhim texnologik yangilik hisoblanadi.

2016-yilda olimlar guruhi CRISPR-Cas tizimlari harakatchanlik xususiyatini yo‘qotib, genomda mustahkamlangan transpozonlardan kelib chiqqanini aniqladi. Filogenetik tadqiqot barcha endonukleazalar Cas endonukleazasi IscB ni tashuvchi transpozonlardan birgina transpozon ajdodidan kelib chiqqanini ko‘rsatdi.

2023-yilda CRISPRdan foydalanadigan ilk gen terapiyasi tasdiqlandi. eksagamglogen autotemsel (savdo nomi Casgevy) deb atalgan va CRISPR Therapeutics hamda Vertex Pharmaceuticals kompaniyalari tomonidan yaratilgan ushbu preparat o‘roqsimon hujayrali anemiya va beta-talassemiya kasalliklarini 12 yosh va undan katta bemorlarda davolash uchun mo‘ljallangan.

CRISPR-Cas tizimlari tuzilishi va vazifasi jihatidan farqlanadi. Shunga qaramay, barcha CRISPR-Cas tizimlari bir qator umumiy xususiyatlarga ega.

CRISPR lokuslari immun himoya vazifasini faqat cas genlari mavjud bo‘lgandagina bajara oladi. Bu genlar odatda CRISPRga bevosita yaqin joylashadi. cas genlari to‘plami CRISPR-Cas tizimining turini belgilaydi. CRISPR lokuslari qisqa (odatda uzunligi taxminan 30—40 nukleotid bo‘lgan) to‘g‘ri takrorlardan tashkil topadi; bu takrorlar bir-biridan hujayra yoki uning ajdodlari to‘qnashgan begona genetik elementlar DNKsidan kelib chiqqan takrorlanmaydigan speyserlar bilan ajratilgan. Speyserlar uzunligi odatda takrorlar uzunligiga yaqin bo‘ladi. Takrorlar va speyserlar ketma-ketligidan oldin yetakchi ketma-ketlik joylashib, unda, odatda, promotor bo‘ladi; aynan undan CRISPR takrorlari va speyserlarining bir yo‘nalishli transkripsiyasi boshlanadi. Speyserlar hujayra genomiga to‘liq birikkan bo‘lib, uning avlodlariga bo‘linish paytida o‘tadi. Bakteriyalarda yangi speyserlarning genomga qo‘shilishi ortiqcha va begona genlarning yo‘qotilishi bilan birga kechadi. Shu sababli bakteriyalar genom hajmining keskin kattalashishidan saqlanadi; yuqori eukariotlardan farqli ravishda, ularning genomida tashqi genetik elementlardan kelib chiqqan takrorlanuvchi ketma-ketliklar katta ulushni egallamaydi.

Turli CRISPR-Cas tizimlarini tuzilishdagi o‘xshashlikdan tashqari, CRISPR vositasidagi immunitetning uch asosiy bosqichi ham birlashtiradi: o‘zlashtirish (ingl. acquisition), ya’ni moslashish (ingl. adaptation), ifodalanish (ingl. expression) va interferensiya (ingl. interference). O‘zlashtirish bosqichida hujayraga kirgan begona genetik elementdan hosil bo‘lgan yangi speyser CRISPR tarkibiga qo‘shiladi. Ifodalanish bosqichida CRISPR transkripsiyalanadi va ma’lum nishonga yo‘naltirilgan qisqa CRISPR-RNKlar (crRNKlar) qayta ishlanib hosil bo‘ladi. Interferensiya vaqtida crRNK-Cas ribonukleoprotein kompleksi crRNK bilan nishon nuklein kislotaning komplementar asoslar juftlashuvi orqali nishonni tanib oladi, keyin esa Cas oqsillarining endo- va/yoki ekzonukleaza faolligi tufayli uni parchalaydi.

Qizig‘i shundaki, CRISPR-Cas tizimlarining ishlashida immun tizimi sutemizuvchilar bilan umumiy bo‘lgan ko‘plab tamoyillar mavjud. Masalan, immunizatsiyasi (ya’ni yangi speyserning kiritilishi) hatto nuqsonli bakteriofag ta’sirida ham yuz berishi mumkin. Bu sutemizuvchilarda o‘ldirilgan patogen kiritilganda ham immun javob yuzaga kelishiga o‘xshaydi.

CRISPR-Cas tizimlari mikroorganizmdan boshqasiga genlarning gorizontal ko‘chishi orqali o‘tishi mumkin. Begona genetik elementlarning bakteriyaga kirishiga qarshilik ko‘rsatish bakteriya uchun hamisha ham foydali emas. Masalan, Staphylococcus epidermidis^[ingl.] bakteriyasida antibiotiklarga chidamlilik pasayishi kuzatilishi mumkin; bunga CRISPR-Cas tizimining ana shu chidamlilikni ta’minlaydigan konyugativ plazmidalarni yo‘q qilishi sabab bo‘ladi. Staphylococcus aureus bakteriyasida CRISPR lokuslari sonining kamayishi hujayradagi profaglar, plazmidalar va mobil genetik elementlar sonini oshiradi, natijada bakteriyaning virulentligi kuchayadi. Biroq ayni sharoitda foydali mobil genetik elementlarning tarqalishiga to‘sqinlik qiluvchi CRISPR-Cas lokuslari yo‘qolib ketishi ham mumkin.

crRNK ifodalanishi va hosil bo‘lishi

Begona genetik elementlar qismlari CRISPRga qo‘shilgach, ularni Cas oqsillarini nishon ketma-ketliklarga yo‘naltirib, bu ketma-ketliklarni aniqlash va yo‘q qilish imkonini beradigan shaklga o‘tkazish talab etiladi. Bunday shakl — muayyan nishonga komplementar noyob ketma-ketlikni o‘z ichiga olgan yo‘naltiruvchi crRNKdir. Dastlab CRISPR takrorlari va speyserlari yagona uzun transkript — pre-crRNK sifatida transkripsiyalanadi, so‘ng u qisqa crRNKlarga bo‘linadi. CRISPRdagi takrorlarning aksariyati palindromlar bo‘lgani uchun pre-crRNKning ularga mos qismlari sochto‘g‘nog‘ichsimon tuzilmalar hosil qiladi. Ko‘p hollarda aynan shu tuzilmalarni pre-crRNKni crRNKga qayta ishlovchi Cas oqsillari taniydi.

Odatda CRISPR transkripsiyasi yetakchi ketma-ketlikka bog‘liq va doimiy, ammo past tezlikda kechadi. Biroq stressli sharoitlarda yoki hujayra faglarga duch kelganda tezlik keskin oshadi, bu esa tez va samarali himoyani ta’minlaydi. Promotor elementlar nafaqat yetakchi ketma-ketlikda, balki takrorlarda ham topilgan. Garchi bir vaqtda butun lokus transkripsiyalanishi mumkin bo‘lsa-da, lokusdagi ayrim speyserlar boshqalaridan tez-tez transkripsiyalanishi ko‘rsatilgan. Ayniqsa, yetakchi ketma-ketlik va birinchi takrordan keyin joylashgan dastlabki bir necha speyser shunday xususiyatga ega. Darhaqiqat, hujayra uchun uzoq o‘tmishda uchratgan begona elementlardan ko‘ra yaqinda to‘qnashgan elementlardan kuchliroq himoyalanish foydaliroqdir.

Ma’lum CRISPR-Cas tizimlarini ikkita asosiy sinf, 6 ta tur va 33 ta kichik turga ajratish mumkin. Tasniflashda muayyan cas genlarining mavjudligi yoki yo‘qligi, operon cas, amino kislota ketma-ketliklari, Cas oqsillarining tuzilishi va CRISPR vositasidagi immunitet mexanizmlari hisobga olinadi.

Bundan tashqari, RNKni nishonga oladigan CRISPR-Rx (CRISPR-CasRx) tizimi ham mavjud. U boshqa CRISPR tizimlaridan, jumladan DNKni nishonga oladigan CRISPR-Cas9dan farq qiladi. Shu sababli CRISPR-Rx genetik kodni o‘zgartirmagan holda gen ifodalanishini bostirishi mumkin.

Birinchi sinf tizimlari ko‘p oqsilli effektor komplekslarga (Cascade, Cmr, Csm) ega. Bu sinfga I, III va IV turdagi tizimlar kiradi. I tur eng keng tarqalgan CRISPR-Cas tizimidir. Ularning nishoni PAM motiviga ega ikki zanjirli DNK bo‘lib, parchalanishni effektor Cascade ko‘p oqsilli kompleksi va Cas3 oqsili amalga oshiradi. III turdagi tizimlar ko‘pincha arxeyalarda uchraydi va Csm hamda Cmr ko‘p oqsilli komplekslariga ega. Ular DNKni ham, RNKni ham taniy oladi, bunda DNKni tanish uchun PAM talab qilinmaydi. Ushbu turdagi tizimlarda nishonlarni Cas10 oqsili effektor nukleazalar bilan birga parchalaydi: IIIA kichik turida Cmr4 (RNKaza, Cmr kompleksi tarkibiga kiradi), IIIB kichik turida esa Csm3 (Csm kompleksi tarkibidagi RNKaza). IV turdagi tizimlar ancha kam uchraydi va ularning tarqalishi hamda ta’sir mexanizmi yetarlicha o‘rganilmagan.

Ikkinchi sinf tizimlarida yagona effektor oqsil mavjud. Bu sinfga II va V turlar kiradi. II turdagi tizimlardan gen muhandisligida faol foydalaniladi; ularga endonukleaza Cas9 xos. Bu turdagi tizimlarda yo‘naltiruvchi RNK vazifasini faqat crRNK emas, balki crRNK va qo‘shimcha RNK — tracrRNK dupleksi bajaradi. crRNK:tracrRNK dupleksi nikaza^[ingl.] domenlari Cas9ning RuvC va HNH qismlarini nishonni kesishga yo‘naltiradi, natijada to‘mtoq uchli^[ingl.] DNK nishonida kesiklar hosil qiladi; bunda nishonning 3'-uchiga yaqin joyda PAM bo‘lishi kerak^{[aniqlashtirish kerak]}. V turdagi tizimlar kam uchraydi va ularda crRNK DNK nishoniga yo‘naltiradigan Cpf1 nukleazasi mavjud. Bu RuvC^[ingl.]ga o‘xshash nukleaza PAMning 3'-uchidan uzoqroq joyda kesish hosil qiladi. Cas9dan farqli o‘laroq, bu nukleaza ikki zanjirli DNKni to‘mtoq emas, uzunligi 5 nukleotidli yopishqoq uchlar hosil qilib kesadi.

Quyidagi jadvalda o‘rganilgan CRISPR-Cas tizimlarining belgilovchi genlari hamda ular kodlaydigan oqsillarning vazifalari keltirilgan. Muayyan belgilovchi genlarning mavjudligi CRISPR-Cas turlari va kichik turlarini farqlovchi xususiyat hisoblanadi.

I va III turdagi tizimlar

Yuqorida aytilganidek, I va III turdagi tizimlar ko‘p oqsilli effektor komplekslardan foydalanadi. Ular uchun pre-crRNKni qayta ishlashda Cas6 oqsilining ishlatilishi ham umumiydir (ba’zan uni ortolog — Cas5 almashtiradi). Bu va boshqa bir qator o‘xshashliklar I va III turdagi tizimlar umumiy ajdoddan kelib chiqqanini ko‘rsatadi.

I tur

I turdagi tizimlar effektor kompleks oqsillarining amino kislota ketma-ketliklari va ularning genlari o‘zaro joylashishi (sinteniya). Eng yaxshi o‘rganilgan I-E kichik turdagi tizim — E. coli bakteriyasining CRISPR-Cas tizimi.

I turdagi tizimlarda Cascade effektor kompleksi tarkibida Cas6 ajralmas subbirlik sifatida mavjud. Shu bois crRNKni qayta ishlash effektor kompleksning o‘zida yuz beradi va yetilgan crRNK unga bog‘langan holda qoladi. Keyin kompleks o‘z nishon ketma-ketligini izlaydi; ehtimol, avval uning PAM motivini taniydi va shundan so‘ng protospeyserning muhim joylari crRNKga komplementar ekanini tekshiradi. CRISPR takrorlarida PAM yo‘qligi tufayli I turdagi CRISPR-Cas tizimiga ega bakteriyaning genomi shu tizim tomonidan parchalanishdan ishonchli himoyalangan. Ikki zanjirli DNK nishonidagi protospeyser Cascade bilan bog‘langanda R-halqa hosil qiladi; buning uchun manfiy supero‘ralish zarur. Ehtimol, bu DNKning nukleozidtrifosfatlarga (NTF) bog‘liq bo‘lmagan tarzda ochilishini yengillashtiradi. Cascade-protospeyser kompleksini Cas3 taniydi. Cas3 HD nukleaza domeniga, shuningdek NTF talab qiladigan zanjirni ajratuvchi va siljituvchi domenga ega. Cas3 DNK:DNK va DNK:RNK duplekslarini ajrata oladi. HD domeni odatda uning N-uchida Cas3 oqsilida joylashadi. HD domeni PAM yaqinida nishonning bitta zanjirini kesadi. Shundan keyin Cas3 Cascadedan ajralib, nukleozidtrifosfatlarni gidrolizlovchi domeni yordamida DNK bo‘ylab siljiydi va qo‘shimcha uzilishlar hosil qiladi.

E. coliCascade kompleksining (erkin hamda DNK bilan bog‘langan holatlardagi) tuzilishi bakteriyasining erkin va DNK bilan bog‘langan Cascade kompleksining tuzilishi deyarli atom darajasidagi aniqlikda tasvirlangan. Nishon Uotson—Krik asoslarining juftlashishi orqali taniladi, biroq protospeyserning har oltinchi nukleotidi crRNKning tegishli nukleotidiga komplementar emas. Shu sababli DNK va crRNK kompleksining umumiy geometriyasi qo‘sh spiral shakliga mos kelmaydi: dupleksning takrorlanuvchi yarim spiral buramalari juftlashmagan asoslar bilan uziladi. Bu DNKning crRNK atrofida aylanib o‘ralmasdan, uning ustidan bukilishiga imkon beradi. Cascadening nishon va unga qarindosh ketma-ketlik bilan bog‘lanishi turli kinetik hamda tuzilish xususiyatlariga ega, shu tufayli kompleks haqiqiy nishonni unga o‘xshash ketma-ketliklardan ajrata oladi. Birinchi holatda interferensiya va nishon parchalanishi, ikkinchisida yangi speyserning kiritilishi yuz beradi. Birlamchi, «sodda» moslashishdan farqli ravishda, bunday yo‘naltirilgan moslashishda faqat Cas1 va Cas2 emas, Cas3 ham ishtirok etishi kerak.

I turdagi 6 ta kichik turdan (I-A — I-F) tashqari I-U kichik turi ham ma’lum (U — ingl. uncharacterized, ya’ni tavsiflanmagan; chunki unda pre-crRNKni kesish mexanizmi va effektor kompleks tuzilishi noma’lum). Ko‘pchilik I turdagi tizimlardan farqli ravishda, I-U tizimidagi Cas3 oqsilining HD domeni C-uchida joylashgan.

III tur

III turdagi tizimlar ikkita kichik turga bo‘linadi: III-A va III-B. Ularga Cas10 oqsilining mavjudligi xos bo‘lib, bu III-A kichik turidagi Csm va III-B kichik turidagi Cmr effektor komplekslarining eng katta subbirligidir. Bundan tashqari, barcha III turdagi tizimlar bitta Cas5 oqsilini va odatda bir nechta paralog Cas7 oqsillarini kodlaydi. Ikkala kichik tur ham pre-crRNKni qayta ishlash uchun Cas6 ortologidan foydalanadi, ammo qayta ishlovchi ferment har doim ham tegishli effektor kompleksning barqaror tarkibiy qismi bo‘lavermaydi (I turdagi tizimlardagidek). 2008-yilda Staphylococcus epidermidis^[ingl.] bakteriyasining III-A tizimi DNK nishonlari bilan, 2009-yilda esa Pyrococcus furiosus^[ingl.] ning III-B tizimi RNK bilan ishlashi aniqlandi. Nishonni muvaffaqiyatli tanish uchun III-A va III-B tizimlarida PAM motivi talab qilinmaydi.

III turdagi tizimlarning keyingi tadqiqotlari III-A va III-B kichik turlarining substrat tanlash xususiyatiga oid yangi jumboqlarni yuzaga chiqardi. Jumladan, S. epidermidis ning III-A tizimi faqat transkripsiyalanayotgan protospeyserlar bilan ishlashi aniqlandi. Bundan tashqari, S. thermophilus va Thermus thermophilus bakteriyalarining Csm komplekslari yashirin RNKni parchalash faolligiga ega ekani va ular RNKni har 6 nukleotidda kesishi ma’lum bo‘ldi. Shunday faollik Cmr komplekslarida ham aniqlandi. S. epidermidis ning III-A tizimi nafaqat sintezlanayotgan transkriptlarni parchalaydi, balki nishonni tanishga aloqasi bo‘lmagan o‘ziga xos amino kislota qoldiqlari Cas10 oqsilidagi qoldiqlar yordamida transkripsiyaga bog‘liq holda DNK nishonini ham kesadi. RNKning gidrolizi Csm va Cmr komplekslari ishtirokida tegishlicha Cas10 emas, balki Csm3 va Cmr4 subbirliklari tomonidan katalizlanadi. Demak, III-A tizimi DNKni ham, RNKni ham parchalashi mumkin. III-B tizimlarining yaxshi tavsiflangan RNKni parchalash faoliyatiga DNKni parchalash qobiliyati ham qo‘shilishi taxmin qilinadi.

III turdagi tizimlar nishonda PAM bo‘lishini talab qilmagani sababli, ularda o‘zining ikki zanjirli DNKsini begonasidan ajratishning I turdagidan farqli mexanizmi mavjud bo‘lishi kerak. Csm kompleksida crRNK nafaqat CRISPR speyseriga, balki unga qo‘shni takrorga ham komplementar bo‘ladi. Shunday qilib, crRNK nishon molekulasi bilan bog‘langanda faqat protospeyserga, hujayra DNKsi bilan bog‘langanda esa qo‘shni takrorga ham ulanadi. Shu belgiga ko‘ra III turdagi tizim hujayraning o‘z DNKsini begona DNKdan ajrata oladi. Qizig‘i shundaki, III turdagi tizimlarda DNK crRNK va nishon DNKning tegishli asoslari juftlashmaydigan joylarga juda yaqin nuqtalardan kesiladi. III turdagi tizimlarda yangi speyserlarni o‘zlashtirish mexanizmlari deyarli noma’lum.

Odatda ajratiladigan III-A va III-B kichik turlaridan tashqari, 2015-yilda ayrim arxeyalarda uchraydigan III-C va III-D kichik turlarini ham ajratish taklif qilindi. III-C tizimlarida Cas10 oqsilining siklaza^[ingl.] domeni faolsizlangan; bundan tashqari, uning amino kislota ketma-ketligi III-A va III-B tizimlaridagi Cas10nikidan sezilarli darajada farq qiladi. III-D tizimlarida Cas10ning HD domeni bo‘lmaydi; shuningdek, o‘ziga xos csx10 geni mavjud bo‘lib, u cas5. III-C va III-D tizimlarining ikkalasida ham quyidagi genlar mavjud emas: cas1 va cas2.

2016-yil fevralida III turdagi CRISPR-Cas tizimiga ega ayrim bakteriyalarda (masalan, dengiz bakteriyasi Marinomonas mediterranea) odatiy Cas1 oqsili o‘rniga ximerik oqsil Cas1-RT ishlashi ma’lum bo‘ldi. U teskari transkriptaza bilan qo‘shilgan. Bunday oqsil tufayli bakteriya RNK genomiga ega patogenlardan teskari transkripsiya yo‘li bilan hosil qilingan speyserlarni o‘z genomiga qo‘sha oladi.

III turdagi tizimlar, xususan Cas10, siklik oligoadenilat ikkilamchi xabarchilarni ishlab chiqarishi aniqlangan. Ular ATF ni siklik mahsulotga aylantiradi; u Csm6ni allosterik faollashtiradi, bu oqsil esa virus RNKsini parchalashga yordam beradi.

II turdagi tizimlar

II turdagi CRISPR-Cas tizimlari noodatiy genetik asosi va molekulyar mexanizmlari bilan boshqalardan ajralib turadi. Jumladan, I va III turdagi tizimlarda crRNKni qayta ishlovchi ko‘p oqsilli komplekslar II turda yagona Cas9 oqsili bilan almashtirilgan; bu oqsil tizim faoliyatining barcha uch asosiy bosqichida qatnashadi. Shu sababli II turdagi tizimlar CRISPR-Casning eng sodda turidir. Bundan tashqari, crRNK biogenezida II turdagi tizimlargagina xos qo‘shimcha elementlar ishtirok etadi. II tur faqat bakteriyalarda uchraydi va I, II hamda III turlar orasida eng kam tarqalganidir. Shunga qaramay, aynan II turdagi tizimlar genomni tahrirlash vositasi sifatida qo‘llanila boshlandi.

II turdagi tizimlar tegishli cas genlarining mavjudligi va ketma-ketliklariga qarab uch kichik turga — II-A, II-B va II-Cga bo‘linadi. I—III turdagi barcha tizimlarga xos cas1^[ingl.] va cas2 genlaridan tashqari, II turdagi tizimlarda qo‘shimcha cas9 geni Cas9 endonukleazasini kodlaydi. Cas9 yangi speyserlarni o‘zlashtirish, crRNK to‘planishi va interferensiyada qatnashadi. Bundan tashqari, II-A tizimlarida speyserlarni o‘zlashtirishda qatnashuvchi oqsilni kodlovchi csn2 geni mavjud. II-B tizimlarida bu gen cas4 bilan almashtirilgan, II-C tizimlarida esa na csn2, na cas4 bor. Cas9 uzunligi kichik turlar orasida farqlanadi; odatda II-C tizimlariga eng qisqa ortologlar xos. Cas9ning nukleaza domeni va ushbu oqsilga xos arginin ga boy klasterdan iborat asosiy qismi, ehtimol, CRISPRga aloqador bo‘lmagan mobil genetik elementlardan kelib chiqqan genlar bilan kodlanadi. Cas9 va CRISPR-Cas tizimlariga aloqador bo‘lmagan uning gomologlari amino kislota ketma-ketliklari o‘rtasidagi katta o‘xshashlikni hisobga olsak, Cas9ni II turdagi tizimlarning to‘la ma’nodagi belgilovchi oqsili deb bo‘lmaydi. Biroq uni ushbu tizimlarning farqlovchi belgisi deb hisoblash mumkin.

II turdagi tizimlarda crRNK biogenezi bir qator noyob xususiyatlarga ega. Jumladan, bu jarayon uchun RNKaza III yordamida qayta ishlash va pre-crRNKning maxsus trans-kodlanadigan CRISPR-RNKlar (tracrRNK) bilan bog‘lanishi zarur. tracrRNK tarkibida crRNKning CRISPR takroridan transkripsiyalangan qismiga komplementar hudud bor. tracrRNK hali ajratilmagan crRNK bilan pre-crRNK tarkibida bog‘lanadi, natijada yetilgan crRNKlar hosil bo‘ladi. Tayyor crRNK-tracrRNK-Cas9 kompleksi qisqa crRNKni saqlaydi; uning 20—24 nukleotidi speyserning 3'-uchiga, yana 20—24 nukleotidi takrorning 5'-uchiga komplementar bo‘ladi. Qayta ishlashning birinchi bosqichi CRISPR takrorlariga mos hududlarda kechib, crRNKning 3'-uchini hosil qiladi. Keyingi bosqichda noma’lum nukleazalar crRNKning 5'-uchini speyserlarga mos qismlarda kesadi. crRNK hujayrada to‘planishi uchun Cas9 kerak; bunga Cas9ning crRNKni qayta ishlashi, uni Cas9 orqali barqarorlashtirishi yoki ikkala vazifasi sababmi — noma’lum.

crRNK-tracrRNK-Cas9 kompleksi crRNKga komplementar va PAMga ega DNK nishonlarini taniydi. I turdagi tizimlardagidek, CRISPR lokuslarida PAM yo‘qligi hujayra DNKsini kesilishdan himoya qiladi. Dastlab Cas9 PAMni taniydi, keyin yonidagi DNKning crRNKga komplementarligi tekshiriladi. DNK nishoni Cas9ning RuvC va HNH motivlari orqali ikkita bir zanjirli uzilish kiritish yo‘li bilan kesiladi. Natijada R-halqadagi protospeyserning PAMga yaqin uchida, PAMdan uch nukleotid oldin, to‘mtoq uchli ikki zanjirli uzilish hosil bo‘ladi.

III-C tizimlarida (xususan, Neisseria meningitidis CRISPR-Cas tizimida) crRNK biogenezining CRISPR takrorlarida joylashgan promotorlardan foydalanadigan muqobil mexanizmi tavsiflangan. Transkripsiyaning muqobil yo‘nalishi RNKaza IIIsiz ham amalga oshishi mumkin.

CRISPR-Cas tizimlarining vazifalari odatda prokariotlarning moslashuvchan immuniteti bilan bog‘lansa-da, bu tizimlar begona genetik elementlardan himoyalanishga aloqasi bo‘lmagan boshqa jarayonlarda, masalan, guruhli xatti-harakatlar, virulentlik, DNKni tiklash va genom evolyutsiyasi^[ingl.]ni boshqarishda ham ishtirok etishini ko‘rsatadigan ko‘plab dalillar mavjud. Quyida CRISPR-Casning immunitetga aloqador bo‘lmagan ayrim ma’lum vazifalari qisqacha keltiriladi.

Bunga misol sifatida yirtqich delta-proteobakteriya Myxococcus xanthusning CRISPR-Cas tizimini keltirish mumkin. U tuproqda keng tarqalgan. Uning hayot sikli meva tanachasi hosil qilish va sporalanish bosqichlarini o‘z ichiga oladi. Bu jarayonlarda alohida hujayralar to‘planib, agregatlar hosil qiladi va miksosporalarga differensiyalanadi va meva tanachasi hosil qiladi. Miksosporalar ajralib chiqqach, alohida bakteriya hujayralariga aylanadi. Bu jarayon kvorumni sezish va hujayra ichidagi signal kaskadlari. Ushbu bakteriyaning CRISPR-Cas tizimi I-C turiga mansub bo‘lib, 7 ta Cas geni va 22 ta speyserli CRISPR lokusiga ega. Oziqa moddalari yetishmaganda tizim A-signalning sintezini hujayralarda boshlaydi. Bu signal amino kislotalar va peptidlardan iborat bo‘lib, fruA genining transkripsiyasini faollashtiradi (operon cas operoni ham Cas8c oqsili orqali ushbu genni faollashtira oladi). Hujayralar bir-biriga tegsa, ularda csgA geni tomonidan kodlanadigan C-signal hosil bo‘ladi. U ham fruA, keyinchalik esa quyidagi genlar ifodalanishini kuchaytiradi: cas. Shunday qilib, cas genlari musbat teskari aloqa halqasining tarkibiga fruA geni bilan birga kirib, mevatana hosil bo‘lishi va bakteriyaning sporalanishida qatnashadi.

CRISPR-Cas tizimlari patogen bakteriyalarda virulentlikni boshqarishda ishtirok etishi mumkin. Masalan, Francisella novicida^[ingl.] bakteriyasida to‘rtta cas genidan va teskari yo‘nalgan, 13 ta speyserli CRISPR lokusidan iborat II turdagi tizim mavjud. U bakterial lipoprotein (BLP) ifodalanishini salbiy boshqaradi; BLP hujayra yuzasidagi virulentlik omilidir. Aynan BLPni xo‘jayin organizmning Tollga o‘xshash 2-retseptorlari immun tizimi taniydi, shu sababli infeksiya muvaffaqiyatli rivojlanishi uchun BLPni kamaytirish zarur. Taxminlarga ko‘ra, Cas9, kichik crRNK (scaRNK) va tracrRNK kompleksi blp transkriptiga bog‘lanib, uni hozircha noma’lum mexanizm orqali parchalaydi. CRISPR-Cas tizimlari quyidagi bakteriyalarda ham virulentlikni boshqarishda ishtirok etadi: Campylobacter jejuni, Neisseria meningitidis, Legionella pneumophila (ushbu bakteriyada barcha cas genlaridan faqat cas2 virulentlikni boshqarishda qatnashadi), ), Listeria monocytogenes (jadvalga qarang).

Ko‘pgina bakteriyalarda CRISPR-Cas tizimlari virulentlikka bog‘liq bo‘lmagan o‘z genlarini boshqarish uchun ishlatiladi. Jumladan, Pseudomonas aeruginosa bakteriyasining I-F turdagi tizimi bioplyonka hosil bo‘lishi bilan bog‘liq genlarni boshqaradi. Bundan tashqari, Cas1 va Cas2 oqsillari toksin-antitoksin tizimlaridek faoliyat yuritib, faglardan himoya qilishi mumkinligi taxmin qilinadi: ular zararlangan hujayralarni tinim holatiga o‘tkazib, keyin nobud qiladi. CRISPR-Cas tizimlarining DNKni tiklashdagi ishtirokiga ham dalillar bor. Masalan, Cas1 E. coli ning I-E turdagi tizimida DNKni tiklash va rekombinatsiya. Gen delesiyasi — cas1 geni yoki unga bog‘liq CRISPR lokuslari yo‘qotilganda DNKni shikastlovchi omillarga sezuvchanlik ortgan va bo‘linishda xromosomalar ajralishi buzilgan.

geni yoki unga bog‘liq CRISPR lokuslarining yo‘qotilishi DNKni shikastlovchi omillarga sezuvchanlikni oshirgan va bo‘linish paytida xromosomalarning ajralishiga xalal bergan.Bakteriya xromosomasini nishonga oluvchi CRISPR-Cas tizimlari genomdagi qayta tuzilishlarda muhim rol o‘ynab, evolyutsiyaning genetik asoslarini ta’minlashi mumkin. Vaholanki, aksariyat hollarda o‘zini nishonga oluvchi Cas oqsillari hujayrani nobud qiladi. Pectobacterium atrosepticum bakteriyasida gorizontal ko‘chish orqali orttirilgan ^{xromosoma orolchalari}, ular genomga genlarning gorizontal ko‘chishi orqali kirgan. Odatda bunday orolchalarga yo‘naltirilgan crRNKlar hujayrani nobud qilgan, biroq omon qolgan ayrim hujayralarda katta xromosoma delesiyalari, jumladan, taxminan 100 juft asosli nishon orolchaning butunlay yo‘qolishi kuzatilgan. Bunday kam uchraydigan hollarda delesiyalar ning umumiy moslashuvchanligini oshirgan..

Qizig‘i shundaki, CRISPR-Cas tizimlari nafaqat prokariotlarda, balki bakteriofaglar va boshqa bir qancha mobil genetik elementlarda (MGE) ham uchraydi. Ehtimol, bu holat CRISPR-Cas tizimlarining bakteriyalar va arxeyalar orasida genlarning gorizontal ko‘chishi orqali tarqalishi bilan bog‘liq. Bunday elementlarning CRISPR-Cas tizimlari boshqa MGElarga qarshi yo‘naltirilib, ular o‘rtasidagi raqobat mexanizmini ta’minlashi mumkin. CRISPR-Cas tizimiga ega MGElarda patogenlik orolchalari^[ingl.] bilan raqobatlashish qobiliyati bo‘lishi mumkin. Bunday bakterial orolchalar fag infeksiyasi vaqtida genomdan kesib chiqariladi va boshqa bakteriyalarga fag kapsidlari orqali uzatiladi. Patogenlik orolchalari o‘z tarqalishi uchun fag kapsidlaridan foydalanib, faglarning ko‘payishini to‘liq to‘sishi mumkin. Bunga ICP1 fagi misol bo‘ladi (Vibrio cholerae), u I-F turiga mansub va 2 ta cas geni va 9 ta speyserga ega (aftidan, u gomolog bo‘lib, Yersinia pestis tizimiga o‘xshaydi). Uning speyserlaridan biri Vibrio cholerae patogenlik orolchasiga komplementardir. Shuning uchun fag kapsidlar uchun patogenlik orolchalari bilan raqobatlasha oladi. Bundan tashqari, ICP1 CRISPR-Cas tizimi yangi speyserlarni o‘zlashtirishi mumkin, bu esa fagning bakteriya-xo‘jayin bilan birga koevolyutsiyalanishiga imkon beradi.

2016-yilda yirik yadro-sitoplazmatik DNKli viruslar da virofaglar dan himoyalanish uchun mo‘ljallangan, CRISPRga o‘xshash himoya tizimi mavjudligi haqida ma’lumot paydo bo‘ldi (xususan, mimivirusning Zamilon virofagiga qarshi). Bu himoya tizimi MIMIVIRE deb nomlangan.

Bakteriyalar populyatsiyasida muayyan CRISPR speyserlari tarqalishiga (demak, tegishli bakteriofaglarga chidamlilikning tarqalishiga) javoban bakteriofaglar tezroq mutatsiyaga uchrashi va hatto genomidagi CRISPR-Cas tizimlari eng ko‘p nishonga oladigan hamda bakteriya genomiga speyser sifatida qo‘shiladigan qismlarni yo‘qotishi aniqlangan.

Ayrim faglar CRISPR-Cas tizimlarining ishlashiga to‘sqinlik qiladigan va infeksiya rivojlanishiga yordam beradigan maxsus oqsillarni (anti-CRISPR oqsillari, Acr) kodlaydi. Pseudomonas aeruginosa faglarini tahlil qilish Acr oqsillarining bir necha turini aniqlash imkonini berdi. Dastlab Acr oqsillari P. aeruginosa ning xromosomalarida profaglar saqlovchi shtammlarida tavsiflangan. Ularning ko‘pchiligida faol I-F turdagi CRISPR-Cas tizimi bo‘lgan bo‘lsa-da, ayrim shtammlarda faglarni nishonga oladigan speyserlar mavjudligiga qaramay, tizim faolsiz qolgan. Faolsiz tizimlarga ega shtammlarning molekulyar tahlili faglar tomonidan kodlanadigan va faglarga sezuvchan fenotip rivojlanishiga mas’ul bo‘lgan bir qancha kichik oqsillarni aniqladi. Acr oqsillari CRISPR-Cas tizimlarini turli yo‘llar bilan bostirishi mumkin. Masalan, I-F turdagi tizimlarda ular Cascade kompleksiga bog‘lanib, uning DNK nishoniga birikishini to‘sadi yoki Cas oqsillariga bog‘lanib, ularni nukleaza faolligidan mahrum qiladi.

Acr oqsillaridan biri xelikaza-nukleaza Cas3ning DNK nishoniga bog‘langan crRNK-Cas kompleksiga ulanishini to‘sadi. Bu kompleks transkripsiya apparatining DNKga birikishini ham cheklaydi; shu tariqa Acr oqsili uni transkripsiya repressoriga aylantiradi. 2015-yil oktabriga ko‘ra, bu CRISPR-Cas faoliyatini oqsil omili bilan boshqarishning ilk ma’lum misoli. Acr oqsillari CRISPR-Cas tizimlariga xos bo‘lishi mumkin, jumladan I-F tizimini bostiradigan oqsillar P. aeruginosaning I-F tizimini bloklaydigan oqsillar P. aeruginosaning I-E tizimiga ham, E. colining I-F tizimiga ham ta’sir qilmagan. Shu bilan birga, P. aeruginosaning I-F tizimini bostiruvchi genlarga ega ayrim faglar P. aeruginosaning I-E tizimini bostiruvchi, biroq E. coli I-E tizimiga ta’sir qilmaydigan kichik supressor oqsillarni kodlagan.

Faglarda CRISPR-interferensiyaga qarshi himoya mexanizmlarining paydo bo‘lishi uzoq davom etgan koevolyutsiya — faglar va ularning xo‘jayinlari.

Olim Ye. V. Kunin fikriga ko‘ra, CRISPR-Cas tizimlarining ishlashini Lamarkning evolyutsion ssenariysi talablariga mos keladigan evolyutsion jarayon sifatida ko‘rish mumkin. Bu quyidagi mezonlarga asoslanadi:

• CRISPR lokuslaridagi genomik o‘zgarishlar (yangi speyserlar kiritilishi) atrof-muhit ta’siri (aniqrog‘i, begona genetik elementlar) tufayli yuzaga keladi.
• O‘zgarishlar genomning maxsus lokuslari bilan chegaralanadi.
• O‘zgarishlar muayyan ta’sirga (muayyan begona genetik elementga) moslashishni ta’minlaydi.

Shu bilan birga, CRISPRga bunday yondashuv tanqid qilinadi. A. Viss fikricha, CRISPR-Casning Lamark mezonlariga mosligi faqat yuzaki xususiyatga ega.

CRISPR-Cas tizimlari Darvincha evolyutsiyaning ayrim belgilarini namoyon qiladi. Jumladan, populyatsiya darajasida speyserlarni tasodifiy o‘zlashtirish va undan so‘ng eng yaxshi moslashuvchanlikka ega omon qolgan klonlarning tanlanishi kuzatiladi.

CRISPR-Cas tizimlari bakteriyalar va arxeyalarda keng tarqalgan bo‘lib, ularning asosiy belgisi takrorlanuvchi ketma-ketliklar va speyserlarning almashinib kelishidir. Shu xususiyat tufayli uzun DNK ketma-ketliklarida CRISPR lokuslarini topish nisbatan oson, chunki lokusdagi takrorlar soni ortgani sari noto‘g‘ri ijobiy natija ehtimoli kamayadi. Uzun ketma-ketliklarda oraliqlar bilan ajratilgan takrorlarni aniqlash orqali CRISPRni izlaydigan dasturlarga CRT, PILER-CR va CRISPRfinder kiradi.

CRISPRni metagenom ma’lumotlari ichidan topish murakkabroq: ko‘plab takrorlar va shtammlarga xos farqlar tufayli odatiy algoritmlar yordamida CRISPR lokuslarini yig‘ib bo‘lmaydi. CRISPR lokuslari sonini oshirish va keyin speyserlar tarkibini tahlil qilish uchun polimeraza zanjir reaksiyasidan foydalanish mumkin, biroq bu usul faqat muayyan CRISPR lokusi haqida ma’lumot beradi va genomlari ma’lumotlar bazalarida mavjud bo‘lgan organizmlarda qo‘llanadi (chunki shu asosda tegishli praymerlarni yaratish mumkin).

CRISPR-Cas tizimlarining vazifalari va ishlash mexanizmlari kashf etilishidan oldin genomning muayyan lokuslarini tahrirlash uchun eng faol ishlab chiqilgan usullar rux barmoqli nukleazalar^[ingl.] (ingl. Zinc-finger nucleases, ZFNs) hamda TAL endonukleazalari^[ingl.] (ingl. Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)dan foydalanishga asoslangan edi. Bu usullar ancha sermehnat, uncha samarali emas va qimmat: har bir yangi nishon lokusi uchun mutlaqo yangi polipeptidlar juftligini yaratish, ifodalash va tekshirish talab etiladi; bu esa usullarning qo‘llanish doirasini sezilarli cheklaydi.

Ammo 2012—2013-yillarda gen muhandisligida CRISPR-Cas tizimlaridan foydalanishga asoslangan, genetik materialni boshqarishning prinsipial jihatdan yangi usullari paydo bo‘ldi. Ular prokariotlar va eukariotlar genomlarini maqsadli tahrirlashga yaroqlidir. Eukariotlarda o‘z CRISPR-Cas tizimlari bo‘lmasa-da, bakteriyalardan olingan tizim elementlari sun’iy ravishda eukariot hujayrasiga kiritilganda yangi muhitda ham ishlay olishi aniqlandi. Zamonaviy CRISPR-Cas texnologiyalarida barcha nishon lokuslar uchun bir xil Cas9 oqsilidan foydalaniladi, ta’sirning o‘ziga xosligini esa oqsil emas, crRNK belgilaydi. ZFN va TALENga asoslangan usullar hozir ham qo‘llanadi va hatto klinik tadqiqotlarda afzal ko‘riladi. Biroq CRISPR-Cas9 usullarining soddaligi, samaradorligi va tejamkorligi ularni genomni maqsadli tahrirlash va DNK bilan bog‘lanishni ta’minlash usullari orasida yetakchiga aylantirdi.

CRISPR-Cas9ga asoslangan usullar tizimlarning tabiiy ishlash mexanizmlariga yaqin: PAM yonida joylashgan nishon ketma-ketlikni tanish uchun RNK ishlatiladi, RNK yo‘naltiradigan Cas9 nukleazasi esa nishon joyida ikki zanjirli uzilish hosil qiladi. Biroq eukariotlar genomini tahrirlashda CRISPR-Cas9 faoliyatining natijasi butun DNK molekulasining parchalanishi emas, balki Cas9 hosil qilgan ikki zanjirli uzilishning tiklanishidir. Tiklash gomologik bo‘lmagan uchlarning birikishi (ingl. non-homologous end joining, NHEJ) yoki gomologik rekombinatsiya orqali kechishi mumkin. Gomologik bo‘lmagan uchlarni biriktirish bilan kechadigan tiklash ko‘pincha kichik kiritmalar yoki delesiyalarni keltirib chiqaradi; ular oqsilni kodlaydigan genlarning o‘qish ramkasini buzib, nishon gen funksiyasining yo‘qolishiga olib kelishi mumkin. Ko‘plab ikki zanjirli uzilishlar hosil qilish katta delesiyalar va hatto inversiyalar paydo bo‘lishini keltirib chiqarishi mumkin.

Aksincha, gomologik rekombinatsiya orqali tiklash olib tashlangan ketma-ketlikning tadqiqotchi o‘zi yaratgan tiklash qolipiga komplementar yangi ketma-ketlik bilan almashtirilishini nazarda tutadi. Shunday qilib, gomologik rekombinatsiya nomaqbul mutatsiyalarni yo‘qotish, yangi allellar yaratish, funksional domenlarni kiritish yoki birlashtirish uchun ishlatilishi mumkin. Bundan tashqari, Cas9ning RuvC yoki HNH domenini mutatsiya orqali faolsizlantirish oqsilni RNK boshqaradigan nikaza ga aylantiradi; u ikki zanjirli emas, bir zanjirli uzilishlar hosil qiladi. Har ikki domenni faolsizlantirish Cas9ni RNK yo‘naltiradigan DNK bilan bog‘lanuvchi oqsil^[ingl.]ga aylantiradi; u nishonni kesmaydi. Bunday holda DNKni bog‘lovchi domenga boshqa vazifali domenlarni ulash mumkin. Bu nishon lokusida transkripsiyani faollashtirish yoki bostirish, xromatinni o‘zgartirish, halqalar hosil bo‘lishini kuchaytirish va boshqa ko‘plab o‘zgarishlarni yuzaga keltirishi mumkin. Bundan tashqari, Cas9ning faolsiz shakli (dCas9, «o‘lik» Cas9) yangi tadqiqot usullariga, masalan, fluoresensiya yordamida tasvirlash yoki lokuslarni keyinchalik jismonan ajratib olish uchun belgilashga asos bo‘ladi.

CRISPR-Cas tizimlari samarali bo‘lsa-da, Cas9ning kelib chiqishi DNK nishonlarini tanlashga cheklovlar qo‘yadi. Masalan, Cas9ning Streptococcus pyogenes oqsilidan foydalanganda faqat ortidan PAM, ya’ni 5'-NGG (N — istalgan nukleotid) keladigan ketma-ketliklarni nishon sifatida tanlash mumkin. Shunga qaramay, PAM zarurati CRISPR-Cas9 uchun jiddiy cheklov emas: inson genomida bunday ketma-ketliklar har 8—12 nukleotidda uchraydi. Genetik konstruksiyalarda ishlatishdan oldin Cas9 geni kodonlarga ko‘ra optimallashtirilishi kerak, bunda ishlatiladigan kodonlar hisobga olinadi: cas9 S. pyogenes genining GC tarkibi past (35 %), shu bois genomi yuqori GC tarkibiga ega organizmlarda Cas9 kodonlarini optimallashtirish zarur bo‘lishi mumkin.

Hozirgi vaqtda genom tahriri uchun II turdagi CRISPR-Cas tizimi ishlatiladi. Odatda SpyCas9 oqsili (bakteriyaning Cas9 nukleazasi — S. pyogenes); ayni paytda qo‘llanish sohasini kengaytiradigan muqobil Cas9 oqsillari ham ishlab chiqilmoqda. Qisqartirilgan Cas9 turlari turli PAM ketma-ketliklarini taniy oladi. crRNK va tracrRNKni alohida transkripsiyalab genomni tahrirlash mumkin bo‘lsa-da, yagona yo‘naltiruvchi RNK (sgRNK) usuli tizimni soddalashtirdi: to‘rt tarkibli RNKaza III:crRNK:tracrRNK:Cas9 tizimini ikki tarkibli sgRNK:Cas9 tizimi almashtirdi. Hozir sgRNK alohida crRNK va tracrRNKdan ko‘proq qo‘llanadi. Cas9 aniqligini oshirish va nojo‘ya ta’sirlarni kamaytirish ishlari davom etmoqda. 2016-yil boshida amerikalik tadqiqotchilar xatolarni deyarli nolgacha kamaytirgani xabar qilingan.

sgRNK va Cas9ni nishon hujayralarga turli usullar bilan yetkazishadi. Masalan, sgRNK va Cas9ni kodlovchi plazmidalardan foydalanib hujayralarni transfeksiya qilish (yoki prokariotlarda transformatsiya qilish) mumkin. Bunday plazmidalarni hujayralarga elektroporatsiya orqali yetkazish mumkin. Ayrim hollarda Cas9ni kodlaydigan plazmidalar ishlatilib, RNK esa PZR yordamida oldindan ko‘paytirilgan amplikonlar^[ingl.].

ko‘rinishida yetkaziladi. 2015-yilda sgRNK va Cas9ni hujayraga maxsus nanochigallar ichida yetkazishning yangi usuli taklif qilindi. Nanochigal zich o‘ralgan bitta DNK zanjiridan iborat bo‘lib, uning bir qismi olib borilayotgan sgRNKga komplementardir. Shu tariqa sgRNK:Cas9 kompleksi chigal ichida mustahkamlanadi. Bundan tashqari, nanochigal o‘z-o‘zidan yig‘ila oladi. Bir nanochigalga bir nechta turli sgRNK:Cas9 kompleksini ulash mumkin. Hujayra bilan kontaktda nanochigal endosomaga tushadi, biroq uni qoplab turuvchi maxsus polimer endosomaning parchalanishini ta’minlab, sgRNK:Cas9ning yadroga yetib borishiga imkon beradi.

Usullarning modifikatsiyalari

Eukariot hujayralari genomini maqsadli tahrirlashda nafaqat Cas9 S. pyogenes, balki Cas9 Streptococcus thermophilus, Neisseria meningitidis Cas9 oqsillaridan hamda Staphylococcus aureus bakteriyasining oqsili (SaCas9) o‘lcham jihatidan 25 % kichikroq (SpyCas9ga nisbatan), shu sababli uni adenoassotsiatsiyalangan virus (AAV) ichiga joylash va tirik organizm hujayralariga terapevtik vektor sifatida yetkazish mumkin.

DNKni kesa olmaydigan Cas9 shakli (dCas9) keng qo‘llanadi. dCas9ni Fluoresan oqsil bilan biriktirish CASFISH (fluoresan gibridizatsiya in situ, CRISPR-Cas9 yordamida bajariladigan) usulining asosidir: bunda nishon lokuslar floresan yorliq bilan belgilanadi. Shu dCas9 yordamida telomeralar, shuningdek, muayyan lokuslarning dinamikasini hujayra sikli davomida kuzatish mumkin.

dCas9 nishon genning promotor hududiga, boshqaruvchi sohalariga yoki kodlovchi hududining boshiga bog‘langanda ushbu gen transkripsiyasini bostirish uchun ishlatilishi mumkin. Bundan tashqari, transkripsiyani bostirish uchun dCas9ga repressor peptid. Aksincha, dCas9 transkripsiya faollashtiruvchi oqsillar bilan biriktirilsa (transkripsiya omillari va effektorlar), u nishon gen transkripsiyasini faollashtira oladi. Bundan tashqari, dCas9ga sun’iy restriksion endonukleazalar hamda epigenomni o‘zgartiruvchi fermentlar, jumladan (DNK-metiltransferazalar, va gistonatsetiltransferazalarni biriktirish mumkin. Bular nishon genlar faolligini shu yo‘l bilan boshqaradi. 2016-yilda sichqon embrional ildiz hujayralarini ikkita embriondan tashqari hujayra liniyasiga (trofoblast va embriondan tashqari endoderma hujayralari) qayta dasturlashga erishildi. Bunda Cdx2^[ingl.] va Gata6^[ingl.] genlari CRISPR vositasidagi faollashtiruvchilar yordamida ishga tushirilgan.

Bundan tashqari, dCas9 monomer ko‘rinishida FokI^[ingl.] endonukleazasi bilan biriktirilishi mumkin. Mazkur ferment dimerlar shaklida ishlaydi. FokI dimerlari nishon ketma-ketliklarda ikki zanjirli uzilishlar hosil qilishi mumkin. FokI monomeriga biriktirilgan dCas9ni yo‘naltirishda ikki sgRNK ishlatiladi, bu tizimning aniqligini sezilarli oshiradi. Har biri alohida sgRNK bilan yo‘naltiriladigan ikkita monomer bir-biridan taxminan 30 juft asos masofada joylashsa, FokI dimerlashib, ikki zanjirli uzilish hosil qiladi.

sgRNK bilan bog‘langan lokuslarni ajratib tozalash uchun muayyan epitoplar tashuvchi dCas9dan foydalanish mumkin: epitoplar. Aslida bu usul xromatin immunopretsipitatsiyasi^[ingl.].

DNK o‘rniga RNK molekulalarini parchalashga qodir Cas9 analoglari topilgan. Bu oqsillardan foydalanish mikroRNK. Cas9 Francisella novicida (FnCas9) RNK genomini nishonga oladigan qilib qayta dasturlanishi mumkin: gepatit C virusini nishonga oladigan qilib qayta dasturlanishi mumkin. Bunda virusning eukariot hujayralardagi hayot sikli bostiriladi. Ushbu tizim asosida turli viruslarga qarshi yuzlab vositalar yaratish mumkin.

2015-yil kuzida CRISPR-Cas9ga muqobil yangi usul — CRISPR-Cpf1^[ingl.] taklif etildi. Cpf1 — V turdagi CRISPR-Cas tizimlarining effektor oqsili bo‘lgan endonukleaza. U Cas9dan kichikroq va ishlashi uchun tracrRNK emas, faqat crRNK kerak bo‘ladi. Shu sababli ayrim hollarda CRISPR-Cpf1 usuli CRISPR-Cas9dan qulayroq bo‘lishi mumkin.

2015-yilda o‘z-o‘zidan klonlanuvchi CRISPR ( ingl. self-cloning CRISPR) usuli ham taklif qilindi. Bunda hujayralarga o‘z-o‘zidan klonlanuvchi palindromik sgRNKni saqlaydigan plazmida, shuningdek, kerakli sgRNKni kodlaydigan ketma-ketlikka ega qisqa ikki zanjirli DNK kiritiladi. Plazmida transkripsiyalanganda hosil bo‘lgan sgRNK Cas9 bilan kompleksda ushbu sgRNKni kodlaydigan plazmida ketma-ketligiga komplementar bog‘lanadi. Cas9 ikki zanjirli uzilish hosil qiladi, u kiritilgan ikki zanjirli DNKni qolip sifatida ishlatadigan gomologik rekombinatsiya orqali tiklanadi. Natijada plazmida yana kerakli sgRNKni kodlaydigan ketma-ketlikka ega bo‘ladi. Har bir yangi nishon lokusi uchun maxsus plazmidalar tayyorlash ko‘p vaqt va mehnat talab qiladigan odatiy CRISPR usulidan farqli o‘laroq, o‘z-o‘zidan klonlanuvchi CRISPR usuli tajriba vaqtini olti kundan uch soatga va xarajatni olti barobar kamaytiradi.

Hozirgi vaqtda CRISPR-Cas tizimlari faoliyatini — doza, ta’sir davomiyligi, o‘ziga xoslik va boshqa parametrlarini — kimyoviy usullar bilan boshqarish faol rivojlantirilmoqda.

2015-yilda AQSHdagi kamida to‘rtta laboratoriya, Xitoydagi va Buyuk Britaniyadagi laboratoriyalar, shuningdek, AQSHning Ovascience biotexnologiya kompaniyasi ham bu rejalarni e’lon qilgan. Shu voqealar munosabati bilan ko‘plab olimlar CRISPR-Cas texnologiyasini inson embrionlari va jinsiy hujayralar boshlang‘ich qatoriga qo‘llashga, jumladan tibbiy maqsadlarda foydalanishga xalqaro moratoriy joriy etishni taklif qildi. Bu olimlar CRISPR bo‘yicha fundamental tadqiqotlarni davom ettirish tarafdori bo‘lsa-da, ularning fikricha, CRISPR-Cas texnologiyasi klinik amaliyotda bemorlarda nojo‘ya mutatsiyalar va irsiy nuqsonlar bo‘lmasligini kafolatlay oladigan darajada hali rivojlanmagan.

2015-yil aprelida xitoylik olimlar guruhi Protein & Cell^[ingl.] jurnalida CRISPR-Cas yordamida yashashga qodir bo‘lmagan inson embrionlari DNKsini o‘zgartirishga urinish natijalarini bayon qilgan maqola e’lon qildi. Ular beta-talassemiya^[ingl.] kasalligiga sabab bo‘ladigan mutatsiyani tuzatishga harakat qilishgan. Yetakchi tadqiqotchining so‘zlariga ko‘ra, Nature va Science jurnallari maqolani axloqiy sabablarga ko‘ra rad etgan. Tajriba natijalari nishon gendan tashqarida yuz bergan ko‘plab mutatsiyalar tufayli uncha umidbaxsh bo‘lmagan. Tadqiqot mualliflari CRISPR-Cas texnologiyasi hozircha reproduktiv tibbiyot^{da qo‘llashga tayyor emasligini ta’kidlashgan.}.

2015-yil dekabrida Vashington shahrida Devid Baltimor raisligida inson genlarini tahrirlash bo‘yicha Xalqaro sammit o‘tkazildi (ingl. International Summit on Human Gene Editing). Sammitda AQSH, Buyuk Britaniya va Xitoy milliy fanlar akademiyalari vakillari inson jinsiy hujayralar boshlang‘ich qatoridagi genlarni o‘zgartirishning axloqiy masalalarini muhokama qildi. Uchrashuvda tegishli huquqiy va axloqiy me’yorlarga rioya qilgan holda fundamental va klinik tadqiqotlarni davom ettirishga qaror qilindi. somatik hujayralardan klinik foydalanishda kiritilgan mutatsiyalar faqat bir individ bilan chegaralanishi, jinsiy hujayralar boshlang‘ich qatori hujayralaridagi genom o‘zgarishlari esa keyingi avlodlarga o‘tishi mumkinligiga alohida e’tibor qaratildi. Ikkinchisi inson evolyutsiyasiga — genetik hamda madaniy jihatdan — kutilmagan va uzoq davom etadigan oqibatlar keltirishi mumkin.

2016-yil fevralida britaniyalik olimlar guruhiga CRISPR-Cas va unga yaqin usullar yordamida inson embrionlarini genetik o‘zgartirishga ruxsat berildi.

2012 va 2013-yillarda CRISPRning gen muhandisligidagi qo‘llanishi bilan bog‘liq yutuqlar boshlanganda CRISPR-Cas usuli «Yil kashfiyoti» mukofotiga, ya’ni Science Magazine^[ingl.] teleko‘rsatuvidagi mukofotga nomzod bo‘lgan. 2015-yilda ushbu mukofotga sazovor bo‘ldi.

• CRISPR-Cas tizimlari: bakteriyalar va arxeyalarda RNK vositasidagi moslashuvchan immunitet : [ingl.] / Muharrirlar: Rodolf Barrangu, Jon van der Ost. — Springer Berlin Heidelberg, 2013. — X+302 bet. — ISBN 978-3-642-34656-9. — ISBN 978-3-642-42929-3. — ISBN 978-3-642-34657-6. — doi:10.1007/978-3-642-34657-6.
• CRISPR-Cas9 : genlarni tahrirlashda inqilob yasash : [ingl.] // Science. — 2014. — Jild. 345, soni. 6204. — B. 1638. — doi:10.1126/science.345.6204.1638-d.
• Makarova, K. S. CRISPR-Cas tizimlarining tasnifi va nomenklaturasi: keyingi yo‘l qanday? : [ingl.] / K. S. Makarova, Y. I. Wolf, E. V. Koonin // The CRISPR Journal. — 2018. — Jild. 1, soni. 5. — B. 325—336. — doi:10.1089/crispr.2018.0033. — PMID 31021272. — PMC 6636873.
• Naymark, Ye. CRISPR-Cas9 turidagi tizimlar keng tarqalgan va ko‘plab variantlarga ega : [arxiv. 21-sentabr 2021-yil] // Elementlar. — 2021. — 21-sentabr.
• Kapitonov, V. V. ISC — Cas9 gomologlarini kodlaydigan bakteriya va arxeyalarning DNK transpozonlari yangi guruhi : [ingl.] / V. V. Kapitonov, K. S. Makarova, E. V. Koonin // Journal of Bacteriology. — 2016. — Jild. 198, soni. 5. — B. 797–807. — doi:10.1128/JB.00783-15. — PMID 26712934. — PMC 4810608.

• CRISPRs veb-serveri (CRISPR bo‘yicha onlayn ma’lumotlar bazasi) . Murojaat qilingan sana: 14-noyabr 2013-yil. Asl nusxadan arxivlangan original 9-noyabr 2013-yil.
• The CRISPR Journal — CRISPRga bag‘ishlangan ilmiy jurnal .
• Artamonova, Irena; Gogleva, Anna. CRISPR tizimlari: prokariotlar immunizatsiyasi . // Sayt Biomolecula.ru (14-noyabr 2014-yil). Murojaat qilingan sana: 30-may 2018-yil. Arxivlangan 18-mart 2018-yil.
• Minina, Yelizaveta. Anti-CRISPR: viruslarning javobi . // Sayt Biomolecula.ru (6-dekabr 2017-yil). Murojaat qilingan sana: 30-may 2018-yil. Arxivlangan 18-mart 2018-yil.
• Borzov, Nikita. Asr jangi: CRISPR va OIV . // Sayt Biomolecula.ru (11-oktabr 2016-yil). Murojaat qilingan sana: 30-may 2018-yil. Arxivlangan 18-mart 2018-yil.
• Shmakova, Anna. CRISPR/Cas9 OIVga qarshi kurashda yordamchi sifatida . // Sayt Biomolecula.ru (19-oktabr 2016-yil). Murojaat qilingan sana: 30-may 2018-yil. Arxivlangan 18-mart 2018-yil.
• Korotayev, Aleksandr; Volkova, Olga. Murakkab narsalar haqida sodda: CRISPR/Cas . // Sayt Biomolecula.ru (24-noyabr 2016-yil). Murojaat qilingan sana: 30-may 2018-yil. Arxivlangan 18-mart 2018-yil.
• Krotov, Anton. So‘zdan amaliyotga: CRISPR-Cas texnologiyasi birinchi marta onkologik kasalliklarni davolashda qo‘llandi . // Sayt Biomolecula.ru (25-noyabr 2016-yil). Murojaat qilingan sana: 30-may 2018-yil. Arxivlangan 18-mart 2018-yil.
• Kondratenko, Yuliya. Teskari transkripsiyadan foydalanuvchi CRISPR tizimlari topildi . // Sayt Biomolecula.ru (9-mart 2016-yil). Murojaat qilingan sana: 30-may 2018-yil. Arxivlangan 18-mart 2018-yil.