Polimeraza zanjir reaksiyasi (PZR)

Polimeraza zanjir reaksiyasi (PZR) — molekulyar biologiya usuli bo‘lib, biologik material (namuna) tarkibidagi nuklein kislotaning muayyan qismlari juda oz miqdorda bo‘lsa ham, ularning miqdorini sezilarli darajada ko‘paytirish imkonini beradi (aynan DNK).

DNKni amplifikatsiya qilish dan tashqari, PZR nuklein kislotalar bilan ko‘plab boshqa amallarni (jumladan, mutatsiyalarni kiritish, DNK fragmentlarini birlashtirish) bajarishga imkon beradi. U biologiya va tibbiyot amaliyotida, masalan, irsiy hamda yuqumli kasalliklarni tashxislash, otalikni aniqlash, genlarni klonlash, yangi genlarni ajratib olish.

Tarixi

1970-yillarning boshlarida norvegiyalik olim Xyell Kleppe^[ingl.] Nobel mukofoti sovrindori Xar Gobind Xorana laboratoriyasida DNKni amplifikatsiya qilish uchun ikkita qisqa, bir zanjirli DNK molekulasi — sintetik praymerlardan foydalanish usulini taklif qildi. Biroq o‘sha vaqtda bu g‘oya amalga oshirilmadi. Polimeraza zanjir reaksiyasi (PZR) 1983-yilda amerikalik biokimyogar Keri Mallis tomonidan ixtiro qilindi. Uning maqsadi dastlabki DNK molekulasini ketma-ket qayta-qayta ikki baravar ko‘paytirish yo‘li bilan, DNK-polimeraza fermenti yordamida amplifikatsiya qilish usulini yaratish edi. PZR usuli haqidagi birinchi maqola 1985-yil noyabrda Science jurnalida chop etildi. Ushbu usul molekulyar biologiya va tibbiyotda tub burilish yasadi. 1993-yilda Keri Mallis buning uchun kimyo bo‘yicha Nobel mukofotini oldi.

PZR dastlab qo‘llanilganida har bir qizdirish-sovutish siklidan keyin reaksiya aralashmasiga yangi DNK-polimeraza qo‘shishga to‘g‘ri kelardi, chunki DNK spirali zanjirlarini ajratish uchun zarur bo‘lgan yuqori haroratda ferment faolligini yo‘qotardi. Jarayon nisbatan samarasiz bo‘lib, ko‘p vaqt va ferment talab qilardi. 1986-yilda polimeraza zanjir reaksiyasi usuli sezilarli darajada takomillashtirildi. Issiqsevar bakteriyalarning DNK-polimerazalaridan foydalanish taklif etildi. Bu fermentlar issiqqa chidamli bo‘lib, reaksiyaning ko‘plab sikllariga bardosh bera olardi. Ulardan foydalanish PZRni soddalashtirish va avtomatlashtirish imkonini berdi. Dastlabki termostabil DNK-polimerazalardan biri Thermus aquaticus bakteriyasidan ajratib olindi va Taq-polimeraza deb ataldi. Bu polimerazaning kamchiligi — noto‘g‘ri nukleotid qo‘shib yuborish ehtimoli ancha yuqoriligidir, chunki unda xatolarni tuzatish mexanizmi (3'→5'-ekzonukleaza faolligi) mavjud emas. Polimerazalar Pfu^[ingl.] va Pwo, arxeyalardan ajratib olingan, bunday mexanizmga ega. Ulardan foydalanish DNKdagi mutatsiyalar sonini sezilarli kamaytiradi, biroq ishlash tezligi (protsessivligi) Taqnikidan pastroq. Hozir Taq va Pfu aralashmalari polimerlanishning ham yuqori tezligiga, ham nusxa ko‘chirishning yuqori aniqligiga erishish uchun qo‘llaniladi.

Usul ixtiro qilingan paytda Keri Mallis Cetus Corporation^[ingl.] kompaniyasida sintetik kimyogar bo‘lib ishlagan (u o‘sha vaqtda genom DNKsi bilan gibridlanish usuli orqali nuqtaviy mutatsiyalarni aniqlashda ishlatiladigan oligonukleotidlarni sintez qilgan). Aynan shu kompaniya PZR usulini patentladi. 1992-yilda Cetus usulga bo‘lgan huquqlarni va Taq-polimerazadan foydalanish patentini Hoffmann-La Roche kompaniyasiga 300 million dollarga sotdi. Biroq Taq-polimeraza 1980-yildayoq sovet biokimyogarlari A. Kaledin, A. Slyusarenko va S. Gorodetskiy tomonidan, undan to‘rt yil avval, ya’ni 1976-yilda esa amerikalik biokimyogarlar Elis Chien, Devid B. Edgar va Jon M. Trela tomonidan tavsiflangani ma’lum bo‘ldi. Shu sababli Promega^[ingl.] kompaniyasi sud orqali Roche kompaniyasini ushbu fermentga bo‘lgan mutlaq huquqlaridan voz kechishga majburlashga urindi. PZR usuli bo‘yicha Amerika patentining amal qilish muddati 2005-yil mart oyida tugadi.

PZRni o‘tkazish

Usul nuklein kislota — DNK ning muayyan qismini fermentlar yordamida sun’iy sharoitda (in vitro) ko‘p marta tanlab nusxalashga asoslanadi. Bunda faqat belgilangan shartlarga mos keladigan qism nusxalanadi va u tekshirilayotgan namunada mavjud bo‘lsagina ko‘payadi. Tirik organizmlardagi DNK amplifikatsiyasidan (replikatsiyadan) farqli ravishda, PZR yordamida DNKning nisbatan qisqa qismlari ko‘paytiriladi. Oddiy PZR jarayonida nusxalanadigan DNK qismlarining uzunligi odatda 3000 asos juftidan (3 kbp) oshmaydi. Turli polimerazalar aralashmasi, qo‘shimchalar va muayyan sharoitlardan foydalanilganda PZR fragmenti uzunligi 20–40 ming nukleotid juftigacha yetishi mumkin. Biroq bu ham eukariot hujayrasidagi xromosoma DNKsining uzunligidan ancha kam. Masalan, insonning eng qisqa yadro xromosomasi (21-xromosoma) 46,71 million asos juftidan iborat.

Reaksiya tarkibiy qismlari

Eng oddiy holatda PZRni o‘tkazish uchun quyidagi tarkibiy qismlar zarur:

DNK-matritsa, tarkibida amplifikatsiya qilinadigan DNK qismi mavjud.
Ikkita praymer, ular kerakli DNK fragmentining turli zanjirlaridagi qarama-qarshi uchlarga komplementar bo‘ladi.
Issiqqa chidamli DNK-polimeraza — ferment, DNK polimerlanish reaksiyasini katalizlaydi. PZRda ishlatiladigan polimeraza yuqori haroratda uzoq vaqt faol bo‘lib qolishi kerak. Shu sababli termofillardan ajratib olingan fermentlar — Thermus aquaticus (Taq-polimeraza), Pyrococcus furiosus^[ingl.] (Pfu-polimeraza), Pyrococcus woesei (Pwo-polimeraza), Thermus thermophilus (Tth-polimeraza) va boshqalar qo‘llaniladi.
Dezoksiribo^[fr.]nukleozidtrifosfatlar (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Mg²⁺ ionlari polimerazaning ishlashi uchun zarur.
Bufer eritma, reaksiya uchun zarur bo‘lgan pH, , eritmaning ion kuchini ta’minlaydi. Tarkibida tuzlar hamda qoramol zardob albumini mavjud.

Reaksiya aralashmasi bug‘lanishining oldini olish uchun probirkaga yuqori qaynash haroratiga ega moy, masalan, vazelin moyi qo‘shiladi. Agar qizdiriladigan qopqoqli amplifikatordan foydalanilsa, bunga hojat yo‘q.

Pirofosfataza qo‘shilishi PZR mahsuloti miqdorini oshirishi mumkin. Bu ferment o‘sayotgan DNK zanjiriga nukleozidtrifosfatlar qo‘shilishida hosil bo‘ladigan yon mahsulot — pirofosfatning ortofosfatga gidrolizlanishini katalizlaydi. Pirofosfat PZRni ingibitsiyalashi mumkin.

Praymerlar

PZRning o‘ziga xosligi matritsa bilan praymerlar o‘rtasida komplementar komplekslar hosil bo‘lishiga asoslanadi. Praymerlar — qisqa sintetik oligonukleotidlar bo‘lib, uzunligi 18—30 asosdan iborat. Har bir praymer ikki zanjirli matritsaning bir zanjiriga komplementar bo‘lib, amplifikatsiya qilinadigan qismning boshlanishi va tugashini belgilaydi.

Matritsa praymer bilan gibridlangach (birikish, ya’ni annealing), praymer DNK-polimeraza uchun matritsaga komplementar zanjir sintezini boshlaydigan nuqta bo‘lib xizmat qiladi (qarang: quyida).

Praymerlarning eng muhim xususiyatlaridan biri — erish harorati (T_m) bo‘lib, bu praymer–matritsa kompleksiga tegishli.

T_m — DNK matritsalarining yarmi oligonukleotid praymer bilan kompleks hosil qiladigan harorat. O‘rtacha hisoblash formulasida T_m qisqa oligonukleotid (va uzun DNK fragmentlari) uchun K ionlari konsentratsiyasi⁺ va DMSO:

T_{m} = 77, 1 + 11, 7 \ln [K^{+}] + \frac{41 (G + C) - 528}{L} - 0, 75 [% D M S O]

hisobga olinadi; bunda

L

— praymerdagi nukleotidlar soni,

K^{+}

— kaliy ionlarining molyar konsentratsiyasi,

G + C

— jami guaninlar va sitozinlar.

soni. Praymerning uzunligi, nukleotid tarkibi yoki birikish harorati noto‘g‘ri tanlansa, matritsa DNKsining boshqa qismlari bilan qisman komplementar komplekslar yuzaga kelishi mumkin. Bu esa nospetsifik mahsulotlar hosil bo‘lishiga olib keladi. Erish haroratining yuqori chegarasi polimeraza ta’sirining optimal harorati bilan cheklanadi, chunki 80 °C dan yuqorida uning faolligi pasayadi.

Praymerlarni tanlashda quyidagi mezonlarga rioya qilish maqsadga muvofiq:

GC tarkibi ~ 40—60 %;
yaqin T_m qiymatlari (farq 5 °C dan oshmasligi kerak);
nospetsifik ikkilamchi tuzilmalar — halqasimon «sochto‘g‘nag‘ich»lar va dimerlar bo‘lmasligi;
3’-uchida guanin yoki sitozin bo‘lishi ma’qul, chunki ular matritsa molekulasi bilan uchta vodorod bog‘i hosil qilib, gibridlanishni barqarorlashtiradi.

Amplifikator

PZR amplifikatorda — probirkalarni davriy ravishda qizdirish va sovutish imkonini beradigan, odatda kamida 0,1 °C aniqlikda ishlaydigan qurilmada o‘tkaziladi. Zamonaviy amplifikatorlarda «issiq start», Touchdown PZR (quyiga qarang) va amplifikatsiyalangan molekulalarni keyinchalik 4 °C da saqlash imkonini beruvchi murakkab dasturlarni sozlash mumkin. Real vaqt rejimidagi PZR uchun fluoresans detektori bilan jihozlangan qurilmalar ishlab chiqariladi. Avtomatik qopqoq va mikroplastinkalar bo‘limiga ega uskunalar ham mavjud; ular avtomatlashtirilgan tizimlarga birlashtirilishi mumkin.

Reaksiyaning borishi

PZR odatda 20—35 siklda o‘tkaziladi va har bir sikl uch bosqichdan iborat.^[≡]

Denaturatsiya

Ikki zanjirli DNK matritsasi zanjirlarni ajratish maqsadida 0,5—2 daqiqaga 94—96 °C gacha (ayniqsa termostabil polimeraza ishlatilsa, 98 °C gacha) qizdiriladi^{[manba 1732 kundan beri ko‘rsatilmagan]}, shunda DNK zanjirlari ajraladi. Bu bosqich erish (denaturatsiya^[fr.]) deb ataladi, chunki DNKning ikki zanjiri o‘rtasidagi vodorod bog‘lari uziladi. Odatda birinchi sikldan oldin matritsa va praymerlarning to‘liq denaturatsiyalanishi uchun aralashma 2—5 daqiqa davomida qizdiriladi.

Birikish (annealing)

DNK zanjirlari ajralgach, praymerlar bir zanjirli matritsaga bog‘lanishi uchun harorat pasaytiriladi. Bu bosqich birikish (annealing) deb ataladi. Birikish harorati praymerlarning tarkibiga bog‘liq bo‘lib, odatda ularning erish haroratidan 5 daraja past tanlanadi. Harorat yuqori bo‘lsa, praymerlar matritsaga yomon bog‘lanadi, past bo‘lsa esa noto‘g‘ri joyga bog‘lanib, nospetsifik mahsulotlar hosil qiladi. Birikish bosqichi 30 soniya davom etadi^{[manba 1732 kundan beri ko‘rsatilmagan]}; bu vaqt ichida polimeraza bir necha yuz nukleotidni sintez qilishga ham ulguradi. Shuning uchun erish harorati 60 °C dan yuqori bo‘lgan praymerlarni tanlash hamda birikish va elongatsiyani 60—72 °C da bir vaqtda o‘tkazish tavsiya etiladi.

Elongatsiya

DNK-polimeraza matritsa zanjirini nusxalaydi , bunda praymer boshlang‘ich nuqta vazifasini bajaradi. Bu — elongatsiya bosqichidir. Polimeraza matritsaga bog‘langan praymerning 3'-uchidan ikkinchi zanjirni sintez qila boshlaydi va matritsa bo‘ylab harakatlanib, yangi zanjirni 5'-uchdan 3'-uchga yo‘nalishda hosil qiladi. Elongatsiya harorati polimeraza turiga bog‘liq. Ko‘p ishlatiladigan Taq va Pfu polimerazalari 72 °C da eng faol bo‘ladi. Elongatsiya davomiyligi ham DNK-polimeraza turiga, ham amplifikatsiya qilinayotgan fragment uzunligiga bog‘liq. Odatda har ming asos juftiga bir daqiqa ajratiladi. Barcha sikllar tugagach, barcha bir zanjirli fragmentlarni to‘ldirish uchun qo‘shimcha yakuniy elongatsiya bosqichi ko‘pincha o‘tkaziladi. Bu bosqich 7—10 daqiqa davom etadi.^{[manba 1732 kundan beri ko‘rsatilmagan]}

Praymerlar bilan chegaralangan reaksiyaning o‘ziga xos mahsuloti miqdori nazariy jihatdan 2ⁿ — 2n ga mutanosib ravishda ortadi, bu yerda n — reaksiya sikllari soni. Aslida har bir siklning samaradorligi 100 % dan kam bo‘lishi mumkin, shu bois amalda P ~ (1+E)ⁿ, bunda P — mahsulot miqdori, E — siklning o‘rtacha samaradorligi.

DNKning «uzun» nusxalari soni ham ortadi, biroq chiziqli ravishda. Shu bois reaksiya mahsulotlari orasida o‘ziga xos fragment ustunlik qiladi.

Kerakli mahsulotning geometrik progressiya bo‘yicha ko‘payishi reagentlar miqdori, ingibitorlar mavjudligi va yon mahsulotlar hosil bo‘lishi bilan cheklanadi. Oxirgi sikllarda o‘sish sekinlashadi; bu «plato effekti» deyiladi.

PZR turlari

RPA (Recombinase Polymerase Amplification — rekombinazali polimeraza amplifikatsiyasi) — termotsiklersiz, izotermik reaksiyada 15 daqiqa ichida DNK/RNKni amplifikatsiya qilish zarur bo‘lgan hollarda qo‘llaniladi.
Ichma-ich PZR (nested PCR) — reaksiyaning yon mahsulotlari sonini kamaytirish uchun qo‘llaniladi. Ikki juft praymer ishlatiladi va ketma-ket ikkita reaksiya o‘tkaziladi. Ikkinchi juft praymer birinchi reaksiyaning mahsuloti ichidagi DNK qismini amplifikatsiya qiladi.
Teskari (invertlangan) PZR^[ingl.] (inverse PCR) — kerakli ketma-ketlikning faqat kichik bir ichki qismi ma’lum bo‘lganda ishlatiladi. Bu usul ayniqsa DNK genomga kiritilgach, unga qo‘shni ketma-ketliklarni aniqlash uchun foydalidir. Teskari PZRda DNKni restriktazalar bilan bir necha marta kesish, so‘ng fragmentlarni birlashtirish (ligatsiya) amalga oshiriladi. Natijada ma’lum fragmentlar noma’lum qismning ikki uchida joylashadi va undan keyin odatdagi PZRni o‘tkazish mumkin.
Teskari transkripsiyali PZR (Reverse Transcription PCR, RT-PCR) — RNK kutubxonasidan ma’lum ketma-ketlikni amplifikatsiya qilish, ajratib olish yoki aniqlash uchun ishlatiladi. Oddiy PZRdan avval mRNK matritsasi asosida revertaza yordamida bir zanjirli DNK molekulasi sintez qilinadi va bir zanjirli kDNK hosil bo‘ladi. U PZR uchun matritsa vazifasini bajaradi. Ushbu usul yordamida ma’lum genlar qayerda va qachon ekspressiyalanishi ko‘pincha aniqlanadi.
Asimmetrik PZR^[ingl.] (asymmetric PCR) — dastlabki DNKning bir zanjirini ustun darajada amplifikatsiya qilish zarur bo‘lgan hollarda o‘tkaziladi. Bu usul ayrim sekvenirlash va gibridlanish tahlili usullarida ishlatiladi. PZR odatdagidek o‘tkaziladi, faqat praymerlardan biri katta ortiqcha miqdorda olinadi. Bu usulning modifikatsiyalaridan biri — Linear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR). Unda turli konsentratsiyadagi praymerlardan foydalaniladi va konsentratsiyasi past praymer yuqori erish haroratiga ega bo‘ladigan qilib tanlanadi, ya’ni uning erish harorati konsentratsiyasi yuqori praymernikidan yuqori bo‘ladi. PZR yuqori birikish haroratida o‘tkaziladi, bu esa barcha sikllarda reaksiyaning samaradorligini saqlashga yordam beradi.
Miqdoriy PZR (quantitative PCR, Q-PCR) yoki real vaqt rejimidagi PZR (real-time polymerase chain reaction) — reaksiyaning har bir siklida muayyan PZR mahsuloti miqdorining o‘zgarishini bevosita kuzatish uchun ishlatiladi. Bu usulda mahsulotning to‘planishini tahlil qilish uchun fluoresans belgili DNK zondlari yoki interkalatsiyalanuvchi bo‘yoq — SYBR Green (yoki uning analoglari) qo‘llaniladi. SYBR Green I^[ingl.] maxsus fluoresans zondlar yoki praymerlarsiz real vaqt rejimidagi PZR davomida mahsulotlarni aniqlash va miqdoriy baholashning sodda hamda tejamkor usulini ta’minlaydi. Amplifikatsiya jarayonida SYBR Green I bo‘yog‘i PZR mahsulotlari DNKsining kichik egatchasiga joylashadi va ko‘k lazer bilan yoritilganda bog‘lanmagan bo‘yoqqa qaraganda kuchliroq fluoresans signal chiqaradi. SYBR Green I hozirgi vaqtda ma’lum bo‘lgan barcha real vaqt PZR qurilmalari bilan mos keladi. SYBR Green I uchun yutilishning asosiy maksimumi 494 nm to‘lqin uzunligiga to‘g‘ri keladi. Bundan tashqari, bo‘yoq spektrida 290 nm va 380 nm da yana ikkita kichik yutilish maksimumi mavjud. SYBR Green I uchun nurlanish maksimumi 521 nm (yashil rang) to‘lqin uzunligiga to‘g‘ri keladi.
Bosqichma-bosqich PZR^[ingl.] (touchdown PCR) — bu yondashuv praymerlarning nospetsifik bog‘lanishi ta’sirini kamaytiradi. Dastlabki sikllar optimal birikish haroratidan yuqoriroq haroratda o‘tkaziladi. Keyin har bir necha sikldan so‘ng harorat asta-sekin optimal qiymatgacha pasaytiriladi. Bundan maqsad — praymerning komplementar zanjirga butun uzunligi bo‘ylab gibridlanishini ta’minlash. Optimal birikish haroratida esa praymer komplementar zanjir bilan qisman gibridlanishi ham mumkin. Agar genom DNKsida praymer bog‘lanadigan joylar ko‘p bo‘lsa, qisman gibridlanish nospetsifik amplifikatsiyaga olib keladi. Ko‘p hollarda PZRning dastlabki o‘nta siklini 72-75 °C birikish haroratida o‘tkazib, so‘ng uni darhol optimal darajaga, masalan 60-65 °C gacha tushirish mumkin.
Molekulyar koloniyalar usuli^[nem.] (geldagi PZR, colony PCR) — akrilamid geli polimerlanadi , ya’ni PZRning barcha tarkibiy qismlari uning yuzasiga joylashtirilib, PZR o‘tkaziladi. Tekshirilayotgan DNK mavjud nuqtalarda amplifikatsiya sodir bo‘ladi va molekulyar koloniyalar hosil bo‘ladi.
kDNK uchlarini tezkor amplifikatsiya qilish usulidagi PZR^[ingl.] (rapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR).
Uzun fragmentlar PZRsi (long-range PCR) — DNKning uzun qismlarini (10 ming va undan ortiq asos) amplifikatsiya qilishga mo‘ljallangan PZR modifikatsiyasi. Ikki polimeraza aralashmasi ishlatiladi. Ulardan biri yuqori protsessivlikka ega (ya’ni bir o‘tishda uzun DNK zanjirini sintez qila oladigan) Taq-polimeraza, ikkinchisi esa 3'-5'-ekzonukleaza faolligiga ega DNK-polimeraza bo‘lib, odatda Pfu polimerazasidir. Ikkinchi polimeraza birinchisi kiritgan xatolarni tuzatish uchun kerak, chunki Taq-polimeraza komplementar bo‘lmagan nukleotid qo‘shilsa, DNK sintezini to‘xtatadi. Bunday nukleotidni Pfu-polimeraza olib tashlaydi. Polimerazalar 50:1 yoki hatto 100:1 dan kichikroq nisbatda olinadi, bunda Taq-polimeraza miqdori Pfu-polimerazanikidan 25—100 baravar ko‘p bo‘ladi.
Grafikda allellar KASP usuli orqali farqlanadi. Har bir nuqta bitta Eppendorf probirkasiga mos keladi; unda bitta matritsa — genotipi aniqlanayotgan DNK mavjud. X va Y o‘qlarida signallar, ular amplifikator tomonidan tegishli FRET-kassetalar (ya’ni allellar) kanallarida qayd etiladigan fluoroforlarning signallari tasvirlangan. Agar bir signal ko‘p bo‘lsa, lokus gomozigot bo‘ladi. Ikkala signal mavjud, ammo ular gomozigot signalidan past bo‘lsa, lokus geterozigot hisoblanadi (grafikda gomo- va geterozigot lokuslarning klasterlari hosil bo‘ladi). Agar amplifikatsiyalangan DNKli probirkadan signallar juda oz, haddan tashqari ko‘p yoki klasterlar orasidagi oraliq holatda bo‘lsa, signallarni qayta ishlovchi statistik dastur lokusning allel holatini aniqlay olmaydi (grafikdagi xochcha belgilar).
Raqobatli allelga xos PZR (kompetitive allele specific, KASP) — maqsadli DNKni genotiplash (DNKda muayyan ketma-ketlik bor-yo‘qligini aniqlash) va SNP hamda indellarni (insertatsiyalar va deletsiyalarni). Reaksiya aralashmasida maqsadli DNK, 3 , uchta praymer (ikkita o‘ziga xos to‘g‘ri, bitta umumiy teskari), ikkita FRET-kasseta (fluorescence resonant energy transfer), ular ikkita ikki zanjirli DNK tuzilmasida fluoresansni so‘ndiruvchi moddalarga bog‘langan, Taq-polimeraza, $M g C l_{2}$ , NTF mavjud. Ikkita to‘g‘ri praymer maqsadli DNKning komplementar o‘rta ketma-ketligi bo‘yicha bir xil, ammo 3' va 5' uchlari bilan farqlanadi. 3'-uch maqsadli DNKga bog‘lanishning o‘ziga xosligini ta’minlaydi, shuning uchun Taq-polimeraza faqat 3'-uchi maqsadli DNK bilan juftlashgan praymerni uzaytiradi. Praymerning 5'-uchi esa komplementar emas va FRET-kassetaning noyob ketma-ketligiga mos keladi. FRET-kassetaning bir zanjirli DNKsi 5'-uchida noyob fluoroforga ega, ammo 3'-uchida so‘ndiruvchi moddasi bor komplementar bir zanjirli DNK bilan juftlashgani sababli fluoresans bermaydigan dupleks hosil qiladi. Maqsadli DNK amplifikatsiya qilinganda maxsus praymerlar unga FRET-kassetalarga mos keladigan noyob ketma-ketliklarni qo‘shadi. Shuning natijasida FRET-kassetalar so‘ndiruvchi modda tashimaydigan, amplifikatsiya qilinayotgan DNK bilan dupleks hosil qila oladi. Bu hodisani har bir FRET-kassetadagi noyob bo‘yoqning fluoresansi orqali aniqlash mumkin. Har bir bo‘yoqning fluoresansi yoki uning yo‘qligi izlanayotgan SNP va indellar mavjudligini bildiradi.
RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA^[ingl.]), ya’ni polimorf DNKni tasodifiy amplifikatsiya qilish PZRsi — genetik ketma-ketligi o‘xshash organizmlarni, masalan, madaniy o‘simliklarning turli navlarini, it zotlarini yoki yaqin qarindosh mikroorganizmlarni farqlash uchun qo‘llaniladi. Bu usulda odatda bitta qisqa praymer (taxminan 10 asos jufti) ishlatiladi. U tekshirilayotgan organizmlar DNKsining tasodifiy joylariga qisman komplementar bo‘ladi. Sharoitlarni — praymer uzunligi, tarkibi, harorat va boshqalarni — tanlash orqali ikki organizm uchun PZR natijalari orasida yetarlicha farqqa erishish mumkin.
Guruhga xos PZR (group-specific PCR) — bir tur ichida yoki turli qarindosh turlar orasidagi yaqin ketma-ketliklarni konservativ praymerlar bilan amplifikatsiya qilish usuli. Masalan, turlarga xos genlararo oraliqni amplifikatsiya qilish uchun ribosomal genlarga 18S va 26S universal praymerlar tanlanadi. 18S va 26S genlarining ketma-ketligi turli turlarda konservativ bo‘lgani uchun ular orasidagi PZR barcha tekshirilayotgan turlarda sodir bo‘ladi. Bunga qarama-qarshi usul — noyob PZR (unique PCR), bunda o‘zaro yaqin ketma-ketliklar orasidan faqat bittasini amplifikatsiya qilishga mo‘ljallangan praymerlar tanlanadi.
Issiq startli PZR^[ingl.] (hot start PCR) — DNK-polimeraza ishtirokidagi PZR modifikatsiyasi bo‘lib, bunda polimeraza faolligi xona haroratida antitanalar yoki ularni taqlid qiluvchi Affibody turidagi kichik molekulalar^[ingl.] yordamida bloklanadi, ya’ni reaksiyani tayyorlash bosqichida, PZRning birinchi denaturatsiyasidan oldin ferment faol bo‘lmaydi. Odatda dastlabki denaturatsiya 95 °C da 10 daqiqa davom etadi.
EP-PCR (error-prone PCR) — tasodifiy mutagenez o‘tkazish uchun ishlatiladigan PZR usuli in vitro sharoitida qo‘llanadi. Bu usulda aniqligi past bo‘lgan Taq DNK-polimerazasidan foydalaniladi; Mn²⁺, Mg²⁺ konsentratsiyasini oshirish va dNTP konsentratsiyalarini teng bo‘lmagan nisbatda ishlatish orqali uning aniqligini yanada pasaytirish mumkin. DNK fragmenti kimyoviy sintez uchun haddan tashqari uzun bo‘lganda variantlar kutubxonasini yaratishda qo‘l keladi.
UPSR — masalan, qadimiy DNK bilan ishlaganda qo‘llaniladigan PZR usuli. Bunda reagentlar aralashmasining begona ketma-ketliklar bilan ozgina ifloslanishi ham maqsadli mahsulot chiqimini kamaytirishi mumkin. Amplifikatsiya paytida dUTP dTTP o‘rnida ishlatiladi; bundan oldin issiqqa sezgir uratsil-N-glikozilaza (UNG) yordamida avvalgi PZR amplifikatsiyalaridan o‘tib qolgan uridin tutuvchi mahsulotlar parchalanadi.
Virtual PZR (in silico PCR, elektron PZR, e-PZR) — kompyuterda matematik tahlil qilish usuli bo‘lib, unda nazariy polimeraza zanjir reaksiyasi praymerlar (yoki DNK zondlari) yordamida tekshirilayotgan DNKni , ya’ni genom, , xromosoma yoki halqasimon DNK hamda boshqa istalgan DNK qismi uchun potensial amplifikatsiyani bashorat qiladi.
yoki boshqa istalgan DNK qismining potensial amplifikatsiyasini bashorat qilish imkonini beradi. Gradientli PZR — bitta PZR sikli davomida praymerlarning turli birikish haroratlarini bir vaqtda sinab ko‘rish imkonini beradigan maxsus molekulyar usul bo‘lib, DNKni aniq amplifikatsiya qilish sharoitlarini optimallashtiradi. Uning prinsipi bitta tajriba sikli doirasida birikish haroratlari oralig‘i va ularga bog‘liq parametrlarni bir vaqtda baholashga asoslanadi. Turli ustunlarda har xil harorat gradientlarini hosil qilish orqali usul aniq DNK amplifikatsiyasi uchun eng maqbul harorat va parametrlar kombinatsiyasini tez aniqlashni osonlashtiradi. Bunday tizimli yondashuv PZR jarayonining samaradorligi va aniqligini ta’minlaydi hamda reaksiya sharoitlarini optimallashtirishni soddalashtiradi.

Agar matritsaning nukleotid ketma-ketligi qisman ma’lum yoki umuman noma’lum bo‘lsa, degenerativ praymerlar qo‘llanilishi mumkin. Ularning ketma-ketligida istalgan asos joylashishi mumkin bo‘lgan o‘zgaruvchan pozitsiyalar mavjud. Masalan, praymer ketma-ketligi quyidagicha bo‘lishi mumkin: …ATH…, bunda H — A, T yoki C.

PZRning qo‘llanilishi

PZR ko‘plab sohalarda tahlil va ilmiy tajribalarni o‘tkazish uchun ishlatiladi.

Kriminalistika

PZR «genetik barmoq izlari» deb ataladigan belgilarni solishtirish uchun ishlatiladi. Buning uchun jinoyat joyidan genetik material namunasi — qon, so‘lak, sperma, soch va boshqalar olinadi. U gumon qilinuvchining genetik materiali bilan solishtiriladi. Juda oz miqdordagi DNK, nazariy jihatdan bitta nusxa ham yetarli. DNK fragmentlarga ajratiladi, so‘ng PZR yordamida amplifikatsiya qilinadi. Fragmentlar DNK elektroforezi orqali ajratiladi. Hosil bo‘lgan DNK tasmalari joylashuvi genetik barmoq izi deb ataladi (genetic fingerprint).

Otalikni aniqlash

«Genetik barmoq izlari» noyob bo‘lsa-da, bir nechta shunday izni solishtirish orqali qarindoshlik aloqalarini aniqlash mumkin.^[≡] Xuddi shu usulni biroz o‘zgartirib, organizmlar orasidagi evolyutsion qarindoshlikni aniqlash uchun ham ishlatish mumkin.

Tibbiy tashxis (PZR-testi)

PZR irsiy va virusli kasalliklarni tashxislashni sezilarli tezlashtiradi va yengillashtiradi. Kerakli gen mos praymerlar yordamida PZR orqali amplifikatsiya qilinadi, so‘ng mutatsiyalarni aniqlash uchun sekvenirlanadi. Virusli infeksiyalarni yuqqan zahoti, kasallikning inkubatsiya davri davomiyligiga qarab, alomatlari paydo bo‘lishidan bir necha hafta yoki hatto oy oldin aniqlash mumkin.

Shaxsiylashtirilgan tibbiyot

Ba’zan dorilar ayrim bemorlar uchun zaharli yoki allergen bo‘lishi mumkin. Buning sabablari qisman dorilar hamda ularning hosilalarini qabul qilishga sezuvchanlik va metabolizm dagi individual farqlar bilan bog‘liq. Bu farqlar genetik darajada belgilanadi. Masalan, bir bemorda muayyan sitoxrom (jigarda begona moddalarning metabolizmi uchun mas’ul oqsil) faolroq, boshqasida esa sustroq bo‘lishi mumkin.

Genlarni klonlash

Genlarni klonlash ( organizmlarni klonlash bilan adashtirmaslik kerak) — genlarni ajratib olish va gen muhandisligi amallari natijasida mazkur gen mahsulotidan ko‘p miqdorda olish jarayonidir. PZR genni amplifikatsiya qilish uchun ishlatiladi; keyin bu gen vektorga — begona genni o‘sha yoki yetishtirishga qulay boshqa organizmga tashiydigan DNK fragmentiga kiritiladi. Vektor sifatida, masalan, plazmidalar yoki virus DNKsi ishlatiladi. Begona organizmga gen kiritish odatda o‘sha gen mahsulotini — RNK yoki ko‘pincha oqsilni olish uchun qo‘llaniladi. Shu yo‘l bilan qishloq xo‘jaligi, tibbiyot va boshqa sohalarda ishlatiladigan ko‘plab oqsillar sanoat miqyosida ishlab chiqariladi.

Genni klonlash jarayonida plazmidadan foydalanish.
(1) A organizmining xromosoma DNKsi. (2) PZR. (3) A organizmi genining ko‘plab nusxalari. (4) Genni plazmidaga kiritish. (5) A organizmi geni joylashgan plazmida. (6) Plazmidani B organizmiga kiritish. (7) B organizmida A organizmi geni nusxalari sonining ko‘payishi.

DNKni sekvenirlash

Fluoresans belgi yoki radioaktiv izotop bilan belgilangan didezoksinukleotidlardan foydalangan holda sekvenirlash usulida PZR ajralmas bosqichdir. Chunki aynan polimerlanish jarayonida DNK zanjiriga fluoresans yoki radioaktiv belgi bilan belgilangan nukleotid hosilalari qo‘shiladi. Sintezlanayotgan zanjirga didezoksinukleotid qo‘shilishi sintezni to‘xtatadi. Bu esa gelda ajratilgandan so‘ng muayyan nukleotidlarning joylashuvini aniqlashga imkon beradi.

Mutagenez

Hozirgi vaqtda PZR mutagenezning (DNK nukleotid ketma-ketligiga o‘zgartirish kiritishning) asosiy usuliga aylangan. PZRdan foydalanish mutagenezni o‘tkazishni soddalashtirdi va tezlashtirdi, shuningdek, jarayonning ishonchliligi hamda takrorlanuvchanligini oshirdi.

Molekulyar jinsni aniqlash

PZRning amaliy qo‘llanishidagi yana bir yo‘nalish — molekulyar jinsni aniqlash^[ingl.] — bu jinsni DNK darajasida erkak va ayol jinslari o‘rtasidagi farqlarga qarab aniqlash.

Adabiyotlar

B. Glik, J. Pasternak . Molekulyar biotexnologiya. Tamoyillar va qo‘llanilishi. Ingliz tilidan tarjima. — M.: Mir, 2002. — 589 bet, rasmlar bilan. — ISBN 5-03-003328-9
L. I. Patrushev . Sun’iy genetik tizimlar. — M.: Nauka, 2005. — 2 jild. — ISBN 5-02-033278-X
S. N. Shelkunov . Gen muhandisligi. — Novosibirsk: Sibir universiteti nashriyoti, 2004. — 496 bet, rasmlar bilan. — ISBN 5-94087-098-8
Ahsen N, Wittwer CT, Schutz E 2001. PZR sharoitlarida oligonukleotidlarning erish harorati: Mg uchun eng yaqin qo‘shnilar tuzatmalari²⁺, dezoksinukleozidtrifosfat va dimetilsulfoksid konsentratsiyalari hamda boshqa empirik formulalar bilan solishtirish Arxiv nusxasi , 2011-yil 2-sentabrda Wayback Machine. Clin Chem, 47:1956-1961.
Kalendar R, Lee D, Schulman AH 2011. PZR, in silico PZR hamda oligonukleotidlarni yig‘ish va tahlil qilish uchun Java veb-vositalari. Genomics, 98(2): 137—144. http://primerdigital.com/tools/ Arxivlangan 16 2012-yil sentabrda .

Havolalar

PZR laboratoriyasi faoliyati. I—II patogenlik guruhlariga mansub mikroorganizmlar bilan zararlangan materialni PZR usulida tekshirishda ishni tashkil etish Arxiv nusxasi , 2010-yil 29-sentabrda Wayback Machine.
«Klassik va molekulyar biologiya» sayti: PZRga oid usullar Arxiv nusxasi , 2007-yil 8-iyunda Wayback Machine